與傳統的2D?細胞培養技術相比，3D?細胞球體提供了更多的仿生微環境，?在許多組織工程應用中已被證明是有價值的。盡管3D?細胞培養具有受益??效應，但目前球體形成方法的可擴展性有限，對球體組織工程的臨床翻譯?提出了挑戰。雖然最近采用的液滴微流體可以提供一個連續的生產過程，?但使用油和表面活性劑，通常低通量，以及額外的生物制造步驟的要求阻?礙了球體培養的臨床翻譯。在這里，使用清潔(例如，無油和無表面活性??劑)?，超高通量(例如，8.5?mL?min-1,10000個球體 s-1)?，單步空氣微流控??生物制造球體形成區室化水凝膠。這種新技術可以可靠地生產一維纖維，?二維平面和三維體積劃分的水凝膠構造，其中每一個都允許空心球形成隔?室的明顯(一)各向同性取向。在噴墨生物打印分區水凝膠中產生的球體在?成軟骨行為方面優于2D?細胞培養物。此外，細胞球體可以從劃分的水凝??膠中獲得，并用于以自下而上的方式構建形狀穩定的厘米大小的無生物材?料的活組織。因此，預計在空氣中微流體生產的球形分區水凝膠可以促進?生產和使用的細胞球體的各種生物醫學應用。
2D?體外細胞培養歷來是組織工程領域的??黃金標準，其目的是修復、再生或替換受?損的活組織。然而，傳統的2D?細胞培養??環境不像它們在體內的天然對應物，因此?對細胞行為產生不利影響。3D?細胞培養??,?如細胞球體或類器官已經允許一種更加?仿生的方法來進行細胞培養。[6-8]已經廣?泛報道，仿生3D?球體培養的細胞在用于??組織工程時優于2D?培養的細胞[9-13]?，并且可以促進更可靠的藥物靶標發現，并?使得具有改進功能的宏觀組織構建體的工?程。例如，載有干細胞球體的生物墨水的?3D?打印改善了生物制品構建體的功能行??為(例如，成軟骨分化和軟骨基質沉積)?。?雖然有希望，但是諸如球體培養等3D?培??養技術的生產方法阻礙了它們的臨床翻譯?,?這些生產方法通常是批處理過程，擁有?屬性較低。
這些批量生產技術如微孔[9,10,12,21-24]和懸掛滴[13,2?5-27]需要多個復雜和耗時的步驟，只能提供有限的球體產量?。盡管特定的生物反應器方法可以提高產量，但它們仍然局??限于批處理過程，與微電池和懸掛液滴等隔離技術相比，這??些批處理過程通常對球體直徑的控制水平較低。?[28]雖然這??可能足以進行小型實驗室規模的實驗，但仍然需要具有高生??產率和高單分散性的強大的單步生物制造技術來促進臨床尺??寸組織的球體技術的臨床翻譯。?[29,30]微流體防火分區最近被研究用于將球體生產從批量生產過?程發展為連續生產過程。在中空生物材料隔室中的細胞微流??體封裝允許細胞球形成微生物反應器的控制連續生產，這提??供了比傳統的批處理工藝更高的生產率。?[31-3提供了比傳統?的批處理工藝更高的生產率。?[31-39]
然而，?由于各種原因，傳統的片上微流控液滴發生器的設計阻?礙了微流控液滴產生的球體在臨床上的廣泛應用。首先，傳統?的芯片上微流體需要使用不可混溶的液體來形成液滴，這通常?需要使用已知具有潛在危害并且常常與臨床應用不相容的油和?表面活性劑。因此，產生的球體形成隔室需要大量清洗，?以試?圖在培養/使用之前除去油和表面活性劑，這與耗時的手工過 ?程有關，這對細胞活力有不利影響。[45,46]其次，雖然傳統的?芯片上微流體允許連續的球體生產，但液滴形成通常僅限于滴?水狀態，導致低吞吐量(<?10μLmin-1) ?，這對于大多數臨床應??用仍然不足。最后，從它們的隔室中回收球體以進行進一步的?生物制造加工通常需要一個復雜的多步驟過程，這可能對細胞?存活產生不利影響。因此，仍然需要一種清潔、快速、細胞友?好和單步生物制造策略，使大型工程組織具有原位球化形成特?性。
在這里，我們介紹了一種新的空氣微流體(IAMF)[48]為基 ?礎的生物打印技術，克服了球體使用的翻譯限制。具體來說，?IAMF?實現了包含無生物材料細胞的隔室的生物物質工程，這??些隔室起到了球體形成微反應器的作用。有利的是，這種創新?方法代表了用于以臨床相關速率(1-8.5 mL?min-1相當于10000??個球體 s-1)產生高密度細胞球體的臨床尺寸水凝膠的工程的單?步生物制造技術。生產能力的顯著提高是由于 IAMF?能夠單分?散地賦予噴墨生物印刷油墨在噴射狀態下具有中空隔室，而傳?統的芯片上方法僅限于更慢的滴水狀態。這種新型的生物制造?過程也是非常清潔的，因為 IAMF?消除了傳統上對油，表面活?性劑或犧牲模板的需要，?以在工程組織內創建空心隔室。除了?傳統的基于機器的噴墨生物打印之外，我們證明我們的內聯自?下而上的生物制造也可以以簡單的手持設備的形式使用，?以手?動打印具有多種復雜性的球體形成的分隔水凝膠，這進一步促?進了該技術與臨床應用的兼容性。雖然微型組織的大規模生產?的翻譯挑戰對于過多的不同組織類型是重要的[28] ，但我們??產生了臨床大小的軟骨組織作為模型組織，同時承認使用這種?方法也可以產生廣泛的其他(器官)形狀。
2.1. 空氣微流體技術在分區水凝膠生物制備中的應用
IAMF?是一種微流體方法，通過在空氣中將液體射流與由壓電?驅動的液體射流產生的恒定周期的水滴流碰撞，使得能夠以超?高吞吐量產生無芯片、無油和細胞相容的單分散微粒。?[48]
在這項研究中，我們將 IAMF?與噴墨生物打印相結合，?以允??許空氣中形成的中空微膠囊的控制合并，從而能夠生產大規模?的區室化水凝膠。為此，將兩個微噴嘴設置與可移動的?XYZ收集工作臺結合使用(圖1a)。
為了形成中空微膠囊，含有氯化鈣(CaCl?2)的核心微噴溶液??與通過使用壓電驅動將振動疊加到微噴嘴上而產生的受控液滴?系統相撞(圖1b)。具有降低表面張力(jcore??>?jalgate)的海藻酸??鹽前體微噴的 Dropjet?聚結允許 Marangoni?驅動的封裝(圖1c)??。這種封裝過程發生在 je?something?(iμD4/阝j2)1/3的時間尺???度上，i，D?，μ?和 j 分別表示微噴密度，直徑，粘度和表面張?力，通常在幾毫秒內。這使得在收集液滴之前的10-100毫秒的??液滴飛行時間內可以完全封裝。這使得能夠生產含有 CaCl2?核?心和海藻酸鹽前體外殼的雙層液滴。由此產生的核殼(即海藻???酸鈣)化合物液滴通過從核心層向海藻酸鹽層擴散的 CaCl2??以內?向外的方式交聯(圖1d)。由于離子海藻酸鹽交聯發生在毫秒范??圍內[50] ?，并且由于交聯的內向外性質，當復合液滴仍然在空?氣中時，?內部海藻酸鹽層交聯，而外部海藻酸鹽層通過 Ca2??+??離子的內向擴散隨時間發生交聯。然后通過可移動的XYZ?收集器或微噴臺以控制的方式收集部分交聯的微膠囊。
值得注意的是，撞擊的時刻是定時的，使得空氣形成的微??囊的交聯仍然在進行中，使得它們在著陸時立即與微囊進行物?理接觸，從而有效地形成包含空心微隔室的瞬時固體3D?構建??體(圖1e)。
我們假設通過使用標準的基于液滴的生物制造方法調整微??膠囊放置，可以以強大的，可預測的和可控的方式形成1D 纖??維，2D 平面和3D 體積的分區水凝膠(圖1f)。使用手持生物打?印裝置(圖1g，h)證明了這種生物制造方法，其允許使用形狀??穩定的區室化水凝膠手動直接填充缺陷(圖1i-k)。該手持方法?預計將促進臨床應用，如在外科手術過程中的原位生物打印。?此外，我們證明了這種新型的生物制造方法也可以與可編程3D生物打印機(圖11，m)相結合，我們證明了允許生產由更復雜?的幾何形狀組成的大規模結構，如形狀穩定的管狀分區水凝膠?(圖1n，o 和電影 S1，支持信息)。IAMF?的超高通量性質(高??達8.5 mL?min-1)(圖 S1，支持信息)允許以快速，直接和單步?方式生物制造臨床尺寸的分區水凝膠(圖1p，q)。
由于 IAMF?產生的液滴的超高吞吐量和短的空中飛行時間，通?常需要快速(毫秒)交聯策略，如所提出的海藻酸鹽離子交聯或?光聚合。然而，依賴于較慢(幾秒鐘)交聯機制的材料，如絲素?蛋白，仍然可以利用海藻酸鈉作為犧牲結構互穿網絡模板。
圖 1.?高度分隔水凝膠的空氣微流體生物制造。 ,a?）使用空氣微流體方法中的兩個噴嘴的分區水凝膠生產過程的示意圖。 ,b)?空氣中液滴形成??和液滴/隔室封裝的顯微照片。 ,c)?表面張力馬蘭戈尼流能夠通過水凝膠前體溶液封裝核心液滴。 ,d)?CaCl2從兩層全水液滴內部向藻酸鹽層擴??散，實現由內而外的離子交聯機制，導致在兩個液滴層之間的界面處交聯藻酸鹽，而殼中的交聯仍然存在,正在進行中。 ,e)?利用微室外殼在受?到沖擊時的持續交聯來設計固體多室水凝膠。 ,f)??隔室的受控沉積允許 1D?纖維、2D?平面和 3D?體積的隔室水凝膠。 ,g)?示意圖和 h)?具有集??成空氣微流體裝置的 3D?打印機的照片。 ,i)?使用 3D?打印機打印的空心管狀分隔水凝膠結構的照片，j)?通過包含葡聚糖-FITC（綠色）和葡聚?糖-TRITC（紅色）染色溶液觀察到不滲漏。 ,k)?用于對隔室水凝膠生物墨水進行手動噴墨生物打印的手持式IAMF設備示意圖。 ,l)?用于直接填??充塑料模具缺陷的手持式 IAMF?設備的照片。,通過手持式噴墨生物打印，模具 m)?之前和 n)?之后的熒光照片，o)?被證明形狀穩定，即使從模具中取出后，也被證明形狀穩定。 ,p）?以 8.5 ?mL??min-1 ?的生產率生產的隔室熒光水凝膠的照片，能夠在 35?秒內填充1.5×?1.5×?1.5?cmmmold?。 ,q)共焦熒光顯微鏡證實了隔室化水凝膠的形成，其中藻酸鹽用葡聚糖-FITC染成綠色，?中空核心用葡聚糖-TRITC染成紅色。
2.2. 使用空氣微流體生物制造對微室和大凝膠的尺寸、形?狀和各向同性控制
藻酸鹽水凝膠的尺寸和形狀以及它們所包含的中空隔室是??根據不同尺寸的微噴嘴在可移動的 XYZ?平臺上的放置來控制??的。內徑為 50?、100?、150?和 200?μm ?的微噴嘴產生的單分散? (CV?<?10%) ?隔室尺寸分別為 140 ?±?5?、219 ?±?14?、277 ?±12?和 347?±?18?μm（圖 2a?、b） ,這代表著對傳統高通量技術?（例如通常與組織尺寸的多分散性相關的大型生物反應器）的?顯著改進。 [28]
具有不同尺寸的隔室水凝膠，如 1D?纖維、2D?片材和 3D?體積，可以通過微噴嘴在多個維度上的移動來實現，其理論??分辨率類似于隔室尺寸（140?±?5、219?±?14、277?±?12和 347?±?18） ,μm（對于內徑分別為 50、100、150?和???200?μm?的核心噴射微噴嘴）。產生這些基本形狀的能力為??通過進一步組裝這些形狀來制造更大的任意形狀的組織提供了?機會。 [53],隔室纖維是通過微噴嘴在單一維度上的移動產生?的（圖2c?，d）。獨特的是，這創建了包含橢圓體隔室的水凝?膠纖維，其伸長率為 1.7?+/-?0.5（圖 2e），其橢圓體形狀??始終遵循纖維的方向（圖 2f）。,這種隔室形狀控制提供了有?趣的可能性，因為眾所周知，在培養/生長微組織的物理空間??中賦予伸長率會導致一致且獨特的行為，從而指導其他形態發?生。?[54]
圖2。在空氣微流控生物制造中產生的一維、二維和三維區域化水凝膠中受控而獨特的形態。A)使用具有不同直徑的各種噴嘴制備的中空海藻酸鹽微膠囊的顯微照片，其有效地控制具有高單分散性(n?=?150)的水凝膠隔室的直徑 b)?。C)一維分隔光纖的亮場顯微照片。D)用葡聚糖 -FITC ?染綠的海藻酸鈉區室化纖維和用葡聚糖?-TRITC?染紅的區室的熒光共聚焦顯微照片。E)與其分隔的纖維(n?=?54)相比，隔室對齊的定量。F)一維?纖維中隔室的橢球延伸率與其隔室化水凝膠的三維體積相比(n?=?54)?。G)用于書寫和織造多室有效載荷(綠色葡聚糖 -FITC?和紅色葡聚糖 -TRITC )的區室化纖維的熒光共聚焦顯微照片。H)二維分區水凝膠片的亮場顯微照片。I)使用葡聚糖?-FITC?和使用 DextranTRITC?染色的紅色隔室的海??藻酸鹽染色的區室化片的熒光共聚焦?z?堆棧。J)單個切片(左)沿?xy?平面(頂部)和?x?平面(底部)劃分的平面的熒光強度直方圖，?以及作為構建體??(右)的平均值。K)熒光共聚焦三維重建海藻酸鹽染色的單層分隔板.。
此外，如使用葡聚糖 -TRITC?(四甲基羅丹明異硫氰酸鹽)??和葡聚糖 -FITC?(異硫氰酸熒光素，圖2g)所示，通過利用2D??中的可移動微噴嘴級，使用微隔室中的各種有效載荷可以用這?種生物制造技術形成多種材料寫作。此外，形成的纖維具有良?好的可操作性(例如，易于手工操作) ，這可能用于諸如編織??(圖2g) ，編織和編織等應用，而不會不可避免地出現纖維故??障。?[55-58]據報道，對齊載細胞纖維的能力能夠改善組織工??程應用，其中對齊是重要的，如肌肉組織工程應用。此外，載?細胞的微纖維也被用于胰島細胞包封，利用植入患者體內時纖?維的易回收性。?[55,62]
在一個維度上移動微噴嘴產生水凝膠微纖維，二維運動允??許形成空間組織的單層水凝膠片(圖2h)。共聚焦 z 疊加分析??證實了印刷水凝膠片內隔室的中空(例如，水性和非交聯)性質?(圖2i)。值得注意的是，形成的水凝膠擁有屬性具有對稱性和?各向異性的特性，這一點通過單個共焦切片的半定量直方圖分?析得到了證實(圖2j)。X 或 Y 平面的平均直方圖數據顯示隔??室的隨機放置，而 Z 平面顯示在特定高度的隔室放置方面是 ?一致的。諸如多層和多種材料的平面中的復雜性可以通過重復?平面形成的受控過程來增加，這導致由多層平面組成的水凝膠?,?其提供了以高度定義的方式使用多種材料或材料性質的潛力?(圖2k，l)。二維載細胞片可以作為補丁起作用，?已經證明其??在心臟組織工程應用和傷口愈合補丁等方面是成功的[63-65]??,?并且可以卷起來模擬管狀結構。?[66]
空氣印刷的退火微膠囊也被證明是容易地能夠迅速地產生??大量的3D 分區水凝膠(圖2m，n)。含有球體的3D 水凝膠已被 ?證明與廣泛的生物醫學應用相關，例如，它一直被證明可以增?加軟骨形成和軟骨形成。?[10,12]雖然放置在二維分隔板中的??隔室具有可重復的各向異性，但三維體積的平均構造直方圖顯?示三維體積是各向同性隔室放置的擁有屬性(圖2o，p)。填料??密度(隔室/容積)可以通過調整隔室尺寸來控制，方法是使用??不同內徑的芯射流微噴嘴以及通過相對流量來控制。在與新噴?射艙碰撞時，沒有觀察到裝配結構的動力位移。
與傳統的0D?水凝膠隔室(如微膠囊)相比，1D?，2D?和3D?材?料的隔室化水凝膠的空氣中微流體生物制造提供了更高的可操?作性。具體而言，水凝膠微膠囊通常懸浮在液體中，因此必須?通過例如移液技術來處理，?由于粘附在培養塑料或移液管尖端?上，導致微粒容易丟失或物理損傷。相比之下，這里描述的
1D?纖維，2D?片材和3D?體積等較大的結構可以使用鏟子和/????或鑷子等工具在宏觀層面上進行處理，這些工具允許簡單的復?雜操作，如書寫，編織或堆積單獨的材料，從而最大限度地減?少損失或損害。
2.3. 細胞負載的分隔水凝膠內軟骨形成球體的超高通量生產
使用IAMF，可以以比傳統微流體高850倍以上的吞吐量生產?大型分隔水凝膠（傳統微流體為10?μLmin-1???[31]，而IAMF分?隔水凝膠為8.5 mL?min-1?）。這種方法可以用于以前所未有的?速度（10 000 個球體?s-1?）大規模生產細胞球體。
為了證明這一點，C20A4軟骨細胞通過將細胞引入核心微射?流溶液(圖3a)被包裹在區室化的水凝膠中。在細胞負載的區室?化水凝膠形成后，立即用多余的培養基洗滌水凝膠，隨后提供?新鮮培養基。在24小時內在水凝膠隔室內形成的細胞球體能夠?在3D 水凝膠(圖3b)和1D 纖維(圖 S2，支持信息)內在隔室內??培養至少21天，其在至少21天的培養中保持穩定。與噴嘴對照?相比，噴射時細胞活力保持高(95.6?± 2.8%?比95.6?± 0.5)?(圖3c，d) ，這是可以預期的，因為潛在的有害剪切力主要由?液體的粘度決定，在本研究中是非常低的。細胞活力在隨后的?細胞培養中保持高水平(96?± 3%)(圖3c，d)包封的細胞的數量通過調節核心微噴溶液中的細胞濃度來??控制，在核心微噴溶液中分別為每隔室13?± 5,38?± 10和73±?15個細胞，分別為2?×?106,5?×?106和107個細胞 mL-1 (圖S3，支持信息)。形成的細胞球體具有單分散的尺寸分布(第1?天 CV?≤10%)?，這表明在?IAMF?產生的區室化水凝膠內控制??細胞球體的形成(圖3e，f)。
圖3。在空氣中生物打印區室化水凝膠中原位形成球體。A)區室化水凝膠內球體形成示意圖。B)第0天，第1天和第21天包裹的軟骨細胞的亮場顯?微照片。C)在第0天(頂部)和第7天(底部)用活細胞染色的活力染色的熒光顯微照片使用鈣黃綠素 -AM?染色綠色，使用同型二聚體乙錠染色紅色??的死細胞。D)在區室化水凝膠(n?=?136個球體)中培養0,1和7天后活的軟骨細胞部分的定量。E)在間隔化水凝膠(n?=?100)中培養21天以上的球體??直徑的定量。F)使用4’，6-二脒基 -2-苯基吲哚(DAPI)和使用?Alexa??Fluor?488鬼筆環肽在分隔的水凝膠中培養21天后使用 F-?肌動蛋白染色的藍色?核球體的共聚焦熒光顯微照片。G)軟骨形成標志物 g)?SOX9?，h)?ACAN?和 i)?COL2A1和纖維軟骨標志物?j)?COL1的相對 mRNA?水平，?以及COL2A1和 COL1之間的 k)相對比率作為來自人原代軟骨細胞的軟骨表型的指示培養為單層或球體在區室化水凝膠中21天(每個 n?=?2,50000個球?體)。使用)?dAPI??(藍色) ?，膠原蛋白2(綠色) ?，聚集蛋白聚糖(紅色)和 m)?dAPI??(藍色) ?，膠原蛋白1(綠色)和透明質酸合酶1(HAS1)(紅色)的免疫?熒光染色在軟骨培養基中培養21天后可視化在分隔的水凝膠中形成的細胞球體的熒光顯微照片。比例尺等于50微米。數據以平均值 ±?SD?表示??。P?<?0.05的顯著性由 *?表示。
使用葡聚糖 -FITC?和使用葡聚糖 -TRITC?染紅的隔室。L)熒光共聚焦3D?重建具有多室有效載荷(綠色葡聚糖 -FITC?和紅色葡聚糖 -TRITC)的雙層?區室化平面。M)三維分區水凝膠體積的亮場顯微照片。N)使用葡聚糖 -FITC?和使用葡聚糖 -TRITC?染色的紅色隔室的區室化體積與海藻酸鹽染?色綠色的熒光共聚焦?z?堆棧。O)單個切片(左)沿?xy?平面(頂部)和?x?平面(底部)分隔體積的熒光強度直方圖，并作為構建體(右)的平均值。P)使?用葡聚糖 -FITC?和使用葡聚糖 -TRITC?染色的紅色隔室，用海藻酸鹽染色的單層區室化水凝膠體積的熒光共聚焦3D?重建。比例尺等于500微米?。數據以平均值 ±?SD?表示。
控制被包裹細胞數量的能力以及由此形成的球體直徑尤其??重要，因為球體直徑已知會影響生物學功能。?[12]以前的研究?報道，與單個細胞和較大的球體相比，通過增加 SOX9，ACAN ?和 COL2A1的表達，同時降低 COL1的表達，每個球體產生50-1???00個細胞，從而改善成軟骨性能。因此，?以107個細胞 mL-1包??裹原代人軟骨細胞進行軟骨形成實驗，其相當于每個隔室73±?15個細胞。
原代人軟骨細胞在分區水凝膠中形成球體或在成軟骨培養??基中作為單層培養21天。與單層相比，區室化水凝膠中的軟骨?細胞表達顯著更高水平的軟骨形成母轉錄因子 SOX9(圖3g)以??及關鍵軟骨細胞外間質組分 ACAN?(圖3h)和 COL2A1(圖3i)?，?同時表達較低水平的不需要的纖維軟骨標志物 COL1(圖3j)和??較高的 COL2A1/COL1比率在細胞球體中與單層培養物相比(圖??3k)。結合起來，基因表達譜證實了在中空區室化水凝膠內自??主形成的細胞微球確實與比單獨分散在整個固體水凝膠中的細?胞更強的成軟骨表型相關聯。為了確認在區室化水凝膠中球體?是否發生了真正的成軟骨行為，對暴露于成軟骨分化培養基21?天的球體進行了免疫熒光染色。事實上，區室化水凝膠中的球?體表達軟骨標志物，如膠原蛋白1，膠原蛋白2，聚集蛋白聚糖?和透明質酸合成酶1(圖31，m)。這些結果表明，在區室化的水?凝膠中自主形成的球體，在類似于傳統的低通量產生的球體的?軟骨形成性能方面優于傳統的單層培養物[9] ，現在可以考慮?用于軟骨工程，特別是作為一種新的方法，?以清潔，細胞相容?,?單步和臨床可伸縮的方式實現細胞球體的益處的臨床翻譯。
2.4. 在空氣中微流控球形成區室化水凝膠允許形狀穩定的臨?床尺寸的無生物材料細胞組織的形成組織形成。然而，球體培養也被發現有利于工程無生物材??料的活組織的形式自下而上的組織工程利用球體作為模塊化的?建設模塊。與傳統的單細胞技術相比，細胞球體允許生產更多?的形狀穩定的組織。這種嚴格的形狀和體積控制在可預測的組?織工程和適形缺損填充中非常重要，因為結構收縮的開始將不?可避免地導致不想要的缺陷和空洞的形成。不幸的是，?由于現?有的球體批量生產過程，這些臨床尺寸的構建體仍然無法達到?,?因為需要大量的球體來形成大規模的組織構建體?; 傳統的球?體生產過程只提供低生產率。為了解決這個問題，我們假設區?室化的水凝膠可以被犧牲，因此作為臨時和可自由選擇的3D微反應器來促進單分散細胞球體的大規模生產。實際上，擴展?到第三維度將顯著提高球體生產率，因為金標準生產平臺的本?質都是二維的。我們推斷，區室化水凝膠的超高通量球體生產?性質將能夠生產形狀穩定，臨床大小的無生物材料的細胞組織?(圖4a)。
為了產生只有315?μL 體積的完整細胞組織所需的球體數量?,?這估計常見的全厚度軟骨缺陷為1.5 cm2 [68]?，將需要總共?150個12孔板的單個孔(每孔3600個球體[9])(圖4b)。因此，訓?練有素的手工勞動的數量被認為是不可擴展的，因此挑戰廣泛?的臨床翻譯球體為基礎的細胞組織。然而，利用連續的 IAMF??分區水凝膠方法，只需要60秒的運行時間就可以產生相同數量?的球體(圖4b)。值得注意的是，特定的醫療應用需要更大的組?織尺寸才能被認為是臨床尺寸，這可以通過將生產運行時間從?一分鐘延長到幾分鐘來輕松實現。預計將多個連續的工匠批處?理過程演變為單個連續的亞分鐘運行時過程，?以促進使用細胞?球體構建塊自底向上工程大型組織的可行性。此外，我們的新?方法也更加生態友好，因為它大大減少了塑料板需要創建這種?自下而上的方法大型活組織的數量。軟骨細胞球體在海藻酸鈉隔離的水凝膠中大量生產，并培?養4天后使用海藻酸鈉裂解酶洗滌步驟酶促回收(圖4c)。
圖4。分區水凝膠作為臨床尺寸細胞組織工程球體生產的3D?平臺。A)臨床大小的細胞組織形成示意圖，包括在區室化水凝膠中的高通量(HT)球?體生產，從區室化水凝膠中檢索球體，瓊脂糖模型中的球體注射制模，?以及隨后的組織形成。B)需要與空氣微流體運行時相比的微孔的理論表示需要創建 ±?540000個球體，這是填充模型注射模具所需的。C)海藻酸裂解酶處理后回收的軟骨細胞球體的亮場顯微照片。D)在培養24小時后?,?在12孔板中的瓊脂糖霉菌中形成的厘米大小的組織的照片。E)培養24小時后形成的組織的縫合顯微照片。F)在原始模具形狀輪廓的頂部，用??球體(頂部)或單個細胞(底部)投影形成的組織。G)由球體或單個細胞形成的組織的組織投影面積相對于霉菌的投影面積(n?=?4)?。H)已形成的組??織與球體或單個細胞相對于霉菌形狀的重疊(針對組織投影區域校正)(n?=?4)?。I)由球體(頂部)或單個細胞(底部)產生的已形成組織的投影，?以紅??色表示角度，?以白色表示測量角度(n?=?4)?。J)培養后軟骨細胞的細胞體積和在分區水凝膠內形成的球體在0(對照) ?，1和4天的培養(n?=?500)。數據以平均值 ±?SD?表示。P?<?0.05的顯著性由 *?表示。
由于海藻酸裂解酶的生物相容性和正交性[69]以及溫和的洗滌??過程，沒有觀察到球體形態的變化。值得注意的是，這種細胞?球體的檢索方法與其他常用的球體形成平臺(例如從微孔中回??收的球體的強力流體動力學攪動)相比，提供了明顯更溫和的??條件的優勢。將大約540000個球體或等量(4??×?107)的單個細胞?注射到厘米大小的骨形模具中以形成厘米大小的工程組織。選?擇骨的符號形狀是因為它適合于評估形成的組織的形狀穩定性?(圖4d?，e)。我們觀察到，與單個細胞相比，利用球狀注射制???模進行大規模組織切割可以獲得更好的形狀穩定性(圖4f)。具??體而言，如組織投射面積所示，大規模生產的球體與較低的組?織收縮相關，在單天培養后，球體為71.7?±?7.3% ?，單個細胞??為47.5?±?0.4%?(圖4g)。
此外，當接種球體(90.3?±?0.2%)時，生產的組織與注射模具的?形狀顯示出更高的重疊，而當使用單細胞(84.0?±?0.1%)時(圖??4h)。這一觀察結果得到了完全細胞狀骨組織物理末端角度的??測量結果的證實。球體的骨形組織(122?±?14?。)的曲線保持與??所用注射模具(116?±?2?。)的高保真度，而使用單細胞懸浮液(176?±?19?。)時角度幾乎喪失(圖4i)。我們推斷，在三維微組織?形成過程中發生的凝聚階段的細胞收縮可能為觀察到的工程化?大細胞組織形狀穩定性的差異提供了解釋。細胞體積分析顯示?,?將來自2D?環境的細胞置于3D?環境中導致單日培養后細胞??體積從6.0?±?2.7降至4.4?±?2.3?pL?(圖4j)。此外，細胞體積在進?一步的3D?培養過程中保持穩定(5.0?±?2.1?pL)。這表明，區室??化水凝膠中最初的球體形成創造了微組織構件，這些構件與來自2D?培養物的單個細胞不同，在用于工程大細胞組織時不會??收縮，因此在用于活組織的注射模具工程時提供了更好的形狀?穩定性。
IAMF?允許成功生產細胞負載的空心分區水凝膠，使原位??形成細胞球體在超高通量，清潔，單一步驟的方式。這種創新?技術被證明與傳統的噴墨生物打印技術兼容，這種技術促進了?具有多種復雜性的分區水凝膠的生產，而手持噴墨生物打印允?許快速和容易的分區球體形成水凝膠的自由生物制造。利用IAMF??的超高通量，在相關的時間框架內實現了基于球體的臨?床尺寸軟骨組織的可擴展生產，這代表了細胞球體臨床翻譯的?重要一步。
IAMF 設置: 用于區室化水凝膠的 IAMF 設置由兩個相似噴??嘴直徑的錐形噴嘴(Idex Health & Science)組成，定位角度??為?± 40?° ,?使用微米精度 XYZ?級(Thorlab)對準。噴嘴連?接到魯爾鎖定玻璃注射器(漢密爾頓)與氟化乙烯丙烯(FEP)管??(ID250?μm，杜邦公司)。流量由低壓注射泵(neMESYS，Cetoni?)控制。主噴嘴連接到一個壓電驅動器，該驅動器以5Vpp 的頻?率工作，頻率在1至10kHz 之間，這取決于所使用的噴嘴直徑??,?從而可以控制微噴的破碎。二次噴嘴的排列使其微射流與一?次微射流的單分散液滴序列相結合。使用高速顯微鏡照相機(SMZ800N，附有 uEye usb 照相機的尼康，IDS)證實了微噴與?液滴列車的受控液滴破碎和合并。
海藻酸鈉分區水凝膠的制備和分析: 主要微噴由10% w/v葡聚糖(40kDa，Pharmosmos)和50?× 10-3m?氯化鈣(CaCl 2)??(Sigma-Aldrich)組成。在?dH2O 中，二次微噴由0.5% w/v 海?藻酸鈉(80-120cP，FUJIFILM Wako)和10% v/v 乙醇(EtOH)組??成。使用不同的噴嘴直徑(50,100,150和200μm)來制造不同艙?室尺寸的艙室。對于直徑為50?μm?的噴嘴，驅動器頻率為6.5??kHz 的一次和二次微噴分別采用0.9和1.1 mL min-1的流量。
對于100?μm 直徑的噴嘴，分別使用2和2.2 mL min-1的流量對?于具有5.5 kHz 的驅動器頻率的一次和二次微噴射，或者分別?使用4和4.5 mL min-1的流量對于一次和二次微噴射，如果表??明總流量為8.5 mL min-1，驅動器頻率為5.5 kHz。對于直徑??為150?μm?的噴嘴，驅動器頻率為4.5 kHz 的一次和二次微噴??分別采用3和3.2 mL min-1的流量。對于直徑為200?μm?的噴嘴?,?驅動器頻率為3.5 kHz 的一次和二次微噴分別采用4和4.2mL min-1的流量。微射流的擁有屬性為 We?± 25，碰撞角度?為?± 40?°?,?相當于 We?Impact?±?10。
使用多種制備方法生產分區水凝膠。對于第一種選擇，將噴嘴固?定在位置上，并將空氣形成的隔室收集在可移動?XZ?收集臺上的培養皿中，用于生產隔離的水凝膠。對于第二種選擇，將噴嘴固定在3D 打?印機(Inkredible?+?，CELLINK)?的可移動打印頭(1m?s-1)上，并將空氣形成?的隔室收集在培養皿中以生產隔離的水凝膠。對于第三種選擇，將噴??嘴固定在手持設備上，允許手動沉積空氣形成的隔室，用于生產隔離??的水凝膠。無論使用哪種裝置，都可以通過控制噴嘴或收集培養皿的??運動來生產一維纖維、二維平面和三維體積的分隔水凝膠。
使用明場顯微鏡(EVOS?FL?成像系統，ThermoFisher)觀察劃分的水凝?膠。間隔直徑用?Feret?直徑測量。通過將0.5?mg?mL-12000?kDa?葡聚糖?–??TRITC?(Sigma-Aldrich)添加到一次微噴中和0.5?mg?mL-12000?kDa?葡聚糖?–?FITC?(Sigma-Aldrich)添加到含有二次微噴的海藻酸鹽中來研究隔室的中?空性質。熒光標記的區室化水凝膠分析使用共聚焦?z?疊加顯微鏡分析??(尼康?A1共聚焦)。利用?ImageJ?軟件對粒度分布、單分散性、角度取向?、橢球伸長率和熒光強度進行了分析。
細胞培養: 將?C20A4軟骨細胞(人軟骨細胞系，Sigma?Aldrich，SCC041)在含有10% 胎牛血清(FBS?，SigmaAldrich)?，100U?mL-1青霉素?(Gibco)和100μgmL-1鏈霉素(Gibco)的?Dulbecco?改良的?Eagle?培養基(DMEM?，Gibco)中培養。培養基每兩周更換一次。將人軟骨細胞在含??有?DMEM?，10%?FBS?，100U?mL-1青霉素，100μgmL-1鏈霉素，0.1 ×?10-??3mL?脯氨酸(SigmaAldrich)的增殖培養基中培養,1% 非必需氨基酸(NEAA?,?Sigma-Aldrich)和1% 抗壞血酸(ASAP?，Sigma-Aldrich)或在含有?DMEM ??,?100U?mL-1青霉素，100μg?mL-1鏈霉素的軟骨培養基中,0.1 ×?10-3mL-??脯氨酸(Sigma-Aldrich)?，1%?非必需氨基酸(NEAA?，SigmaAldrich)和1%?????抗壞血酸(ASAP?，Sigma-Aldrich)?，10ng?mL-1TGFb3(R &?D?系統)和0.1 ×????10-6m 地塞米松(Sigma-Aldrich)。達到80%?融合時，細胞傳代。
細胞培養物保存在37 °C，含5% CO2的潮濕環境中。細胞包裹:?當制?備細胞負載的區室化水凝膠時，微射流溶液中的?dH2O 被無磷酸鹽(Gibco)的?DMEM?所取代。使用胰島素乙二胺四乙酸(Invitrogen)分離細?胞，用培養基洗滌，隨后通過40μm 細胞過濾器(EASYstrainer?，Greiner ?)以確保單細胞懸浮。除非另有說明，然后將細胞懸浮于初級微噴溶液?中的107細胞?mL-1。然后將載有細胞的溶液裝入并保存在冰冷的氣密??注射器中，持續封裝過程(<?10分鐘)。在細胞封裝實驗中，噴嘴直徑為?100μm?，一次和二次微噴的流量分別為2和2.2?mL?min-1，壓電致動器??的頻率為5.5?kHz。載細胞的區室化水凝膠收集在培養皿中或直接進入?培養板。生產完成后，立即用培養基清洗分隔的水凝膠，?以洗去多余?的乙醇，維持高細胞活力。最后，加入新鮮培養基，將分離的水凝膠?置于培養基中。
通過明場顯微鏡(EVOS?FL?成像系統，ThermoFisher)監測細胞包裹后?的細胞聚集。根據制造商的方案(Invitrogen)?，通過用鈣黃綠素?AM?和??乙錠同源二聚體?-1染色研究細胞活力，并使用數字熒光顯微鏡(EVOS ????FL?image?System?，ThermoFisher)進行成像。
對于額外的分析，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌載有細胞的區室化??水凝膠，并使用10% 緩沖福爾馬林溶液(Sigma-Aldrich)固定。使用0.1%?Triton?X-100(Sigma-Aldrich)使細胞透化，隨后用2.5?U?mL-1鬼筆環肽?-F488(Thermo?Fisher?Scientific)和10μgmL-1DAPI?(Thermo?Fisher?Scientific )分別染色?F- 肌動蛋白和細胞核。熒光染色的樣本分析使用共聚焦顯??微鏡(尼康共焦?A1)和?ImageJ?軟件。
基因表達分析: 將原代人軟骨細胞包裹在分區水凝膠中，在成軟骨?細胞培養基中培養21天。作為對照，原代人軟骨細胞單層培養。用TRIzol?(Invitrogen)裂解緩沖液制備用于即時聚合酶鏈式反應(qPCR)分析?的樣本，并按照供應商提供的方案，使用?miRNeasy?試劑盒(QIAGEN)進?行?RNA?分離。使用?iScript?cDNA?合成試劑盒(Bio-Rad)合成?cDNA。然后??,?在?CFX?Connect?實時系統(BioRad)上使用?SensMix?SYBR?和熒光素試劑?盒(Bioline)對?cDNA?進行?qPCR。
軟骨生產分析: 將原代人軟骨細胞包裹在分區水凝膠中，在成軟骨??培養基中培養21天。使用10% 緩沖福爾馬林溶液固定球體，使用0.1%???Triton-X?(Sigma-Aldrich)透化，使用10%?牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)封??閉，并使用1:100抗膠原蛋白1(Novus?生物學)染色,1:100抗膠原2(Abcam )?，1:100抗聚集蛋白聚糖(Abcam)或1:200抗透明質酸合酶1(Abcam)與1:??250 AF488(Invitrogen)和1:200AF647(Abcam)標記的二抗和1:100?DAPI?作?為計數染色。
大細胞組織形成: 將?C20A4細胞包裹在區室化的水凝膠中并培養四???天，在此基礎上通過?PBS?洗滌和10U?mL-1海藻酸裂解酶(Sigma-Aldrich)??在37 °C 溫育30分鐘來回收細胞球體。將大約54萬個球體(± 4 ×?107個細?胞)注射到瓊脂糖骨狀霉菌中，形成一個大的細胞組織。以4 ×?107單個?細胞為對照，注射入骨霉菌中。可以注射細胞的霉菌總體積為315μL?????,?如前所述生產。[70]使用前將瓊脂糖模型在培養基中溫育24小時。
使用宏觀攝影(佳能?EOS?6D)和明場顯微鏡(EVOS?FL?成像系統，ThermoFisher)分析形成的大型組織。對培養0,1,4天的球體進行胰蛋白?酶消化，通過亮場成像分析細胞大小/體積。使用ImageJ?軟件分析大?的組織表面積、形狀和細胞體積。
統計分析: 數據以平均值± SD?表示。每個實驗的樣本量在圖形描述??中報告。通過單因素方差分析確定顯著性。用?* 表示?p < 0.05的顯著性?。所有統計分析均在?OriginPro2017中進行。
關鍵詞
聚集體，生物制造，細胞包裹，隔離水凝膠，空氣中微流體，?微流體，球體
