摘要
隨著3D生物打印和人類誘導多能干細胞(hiPSCs)的出現，組織工程領域發展迅速，但由于缺乏功能豐富的厚組織，影響有限。繞過這一限制的方法之一是用含有 hiPSCs 的3D 生物打印組織。通過這種方式，iPSCs可以在實質細胞分化之前增殖并填充厚組織塊。在這里?,?我們設計了一個灌注生物反應器，用于裝載hipsc的3d生物打印室，?目的是在分化之前在?整個結構中增殖hipsc，以產生厚組織模型。生物反應器由數字光投影制成，經過優化，可?以在水凝膠室內部灌注而不會泄漏，也可以在外部提供流體流動，從而最大限度地提高整??個室壁的營養輸送。經過7天的培養，我們發現在3ml min-1下間歇灌注(每15分鐘15秒)，相?對于在靜態條件下培養的類似腔室，工程組織中的干細胞集落密度增加了1.9倍。我們還觀?察到，相對于靜態對照，灌注結構的組織壁內的菌落分布更均勻，反映了培養基中營養物??質的均勻分布。在流體流動的作用下，hiPSCs保持多能性和增殖性，產生平均約1.0 dyncm-2?的壁剪切應力。總的來說，這些充滿希望的結果在灌注干細胞水凝膠后支持多種組織類?型的產生，并改善了厚度，因此增加了功能和實用性。
三維（3D）生物打印技術為創建人體疾病模 型提供了巨大的潛力，可以在體外對疾病機制、 進展和治療進行器官級研究。生物打印還可以生 成功能性替代組織，用于治療各種疾病。然而， 人體每個器官都有數十億個細胞，要獲得足夠數量的細胞來創建具有代表性的體外組織并非易事 。雖然擠壓生物打印的細胞密度通常高于其他打 印方式，但目前通常只能達到每毫升生物墨水數 千萬個細胞的規模[1]。目前正在開發使用球體 ?或胚狀體進行無支架生物打印的方法[2-4]，從而提高打印組織的細胞密度。然而，除了自身的一系列局限性（包括球形變異性、可打印性和打印分辨率方面的挑戰）外，這些方法仍然需要細胞放大和大容量培養基才能達到生理密度。為了解決工程組織中細胞密度低的問題，人們引入了原位干細胞擴增和分化的生物打印方法[5-11]。在這種方法中，被打印在生物墨水中的是干細胞而不是實質細胞。干細胞在分化成所需細胞類型之前，可在工程組織中擴增。這對涉及增殖或遷移能力有限的細胞類型（如心肌細胞）的應用尤其有益，也可作為使用源自患者的原始細胞的替代方法[5, 12, 13]。這種方法的另一個優點是，在分化過程中形成的關鍵細胞-細胞、細胞-細胞外基質（ECM）和 ECM-ECM 連接可以保持不變，不會被破壞。這一點非常重要，因為 ECM 組織對工程心臟組織的功能至關重要[14]。此外，在原位分化過程中形成并保存在三維生物打印結構中的微環境可實現人腔肌泵（hChaMP）的組織和心臟功能[5]。使用人類誘導多能干細胞（hiPSCs）打印的hChaMP 是由一種生物墨水生成的，這種墨水含有專門針對 hiPSC 生長和分化為心肌細胞而優化的 ECM。hiPSCs 在心肌細胞分化前增殖兩周，從而使結構中的細胞密度更符合生理要求。因此，hChaMP 在整個結構中顯示出連續的肌肉功能，這一點可以通過光學繪圖和肌肉組織每次收縮時泵送液體的能力來證明。然而，雖然使用干細胞進行生物打印以及隨后的擴增和分化是一項很有前景的技術，但由于營養供應不足，hChaMP顯示出有限的組織厚度[5]，這是組織工程領域眾所周知的問題。營養物質（尤其是氧氣）的供應限制了工程組織的厚度，通常只能達到 100-200 微米的存活組織[15]。然而，有了流體流動，就可以通過對流擴大營養物質的獲取，從而開發出許多用于工程組織的生物反應器[16, 17]。由于多能干細胞對微環境敏感，而剪切應力已被證明可誘導小鼠干細胞造血[18]，并促進干細胞衍生前體形成內皮細胞[19, 20]，因此在工程組織中對流擴增hiPSC可能會誘發無意分化。相反，許多生物反應器研究表明，利用流體力學擴增干細胞聚集體或微載體，其效力損失有限[21-25]。在此，我們介紹了為hChaMP開發的灌注生物反應器。我們的研究表明，間歇灌注hChaMP可使細胞密度在培養一周后增加近兩倍。
此外，盡管暴露在剪切應力下，hiPSCs仍能保持多能性，而剪切應力近似低于其他常見的干細胞擴增生物反應器。這些結果表明，擴增的iPSCs分化成所需細胞類型后，有望生成厚組織模型。
2.1. hChaMP制造
通過Autodesk Meshmixer和Blender（圖1(a)），根據之前報道的結構[5]重新設計了hChaMPs ，并在Slic3r中生成了g代碼。打印前一天，在含有 75% mTeSR1（STEMCELLTechnologies，cat#85850）、25% 醋酸（20 mM）和1.3% 苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸鋰（LAP，Allevi）的溶液中，將甲基丙烯酰明膠（GelMA；明尼蘇達大學生物打印設備）在60℃下重組至 26.7% w/v。甲基丙烯酸膠原（ColMA；Advanced Biomatrix，cat#5198）在 20 μM乙酸中溶解至2% w/v，溫度為37℃。打印前，混合GelMA和ColMA溶液（3:1 GelMA溶液：ColMA溶液，即 20% w/v GelMA，0.5% w/v ColMA），并用1M 氫氧化鈉中和。這些研究中使用了 hiPSCs（在肌球蛋白重鏈基因[26]下過表達細胞周期蛋白 D2，雌性）。hiPSCs 在 基底膜基質（Corning，cat#08-774-552）上的 mTeSR1 中保存，并通過 ReLeSR（STEMCELL Technologies，cat#05872）定期傳代。打印時，用細胞消化液（Millipore Sigma，cat#A6964）將匯合度為 60%-80% 的 hiPSCs單個化。細胞懸浮液清洗后離心兩次，以除去可能降解基質支架的多余細胞消化液。然后將細胞以 3000 萬個細胞 ml-1 的量重懸在 ECM 溶液中，該溶液含有 187 μg ml-1 小鼠層粘連蛋白/腸粘連蛋白（LN；Corning，cat#354259）、187μg ml-1 人纖連蛋白（FN；Corning，cat#356008 或 R&D systems，cat#1918-FN-02M）和10 μM Y-27632 ROCK 抑制劑（Selleckchem，cat#S1049）的 mTeSR1，并在室溫下孵育 15 分鐘。hChaMPs 在INKREDIBLE擠壓式生物打印機（CELLINK）上打印。為了提高低粘度生物墨水的分辨率，打印是在基于 FRESH v2.0[27]的支撐浴中進行的。支撐浴是在生物安全柜中制作的，以保持無菌狀態；52.5%的無菌Milli-Q水和47.5%的乙醇混合物在輔助容器中制作的水浴中加熱到45℃。以每分鐘400轉的速度攪拌混合物，并用鋁箔覆蓋以減少蒸發。加入氫氧化鈉（1mM）使pH值升至7，然后加入B型明膠（SigmaAldrich，cat#G9382，2% w/v）和阿拉伯樹膠（Sigma Aldrich，cat#9752，1% w/v）。溶液在45℃下混合10分鐘，然后冷卻至35℃，然后緩慢冷卻至25℃(<1℃ min-1)。然后降低溫度至10℃，再攪拌5分鐘。將混合物轉移到錐形管中，在100G下離心4分鐘。將上清替換為冷的、無菌的Milli-Q水，管子旋轉，在500G下離心5分鐘。然后用冷的、無菌的1X磷酸鹽緩沖鹽水(PBS;Fisher Scientific, cat#BP3994)，并保存在4℃，直到打印當天。此時，在1200G下離心3分鐘，去除多余的PBS，薄層紫外線照射30分鐘。生物墨水在27°C下用27 G, 1英寸針頭打印。如前所述[5]，為了保持打印結構的一致性(這對灌注設置很重要)，壓力根據針頭的墨水滴速而變化。對于給定的打印結構，這里使用的墨水，滴針之間的滴速為3.1秒。在六個面各打印20秒后，墨水與藍光(405 nm)交聯。然后將支撐液中的打印物移到培養箱中熔化支撐液，然后用溫暖、無菌的Dulbecco PBS (DPBS;不含Ca2+和Mg2+;Thermo Fisher Scientific，編號14190144)。hChaMPs在5μM Y-27632的mTeSR1中培養過夜，在靜態條件下允許細胞附著。
圖1所示。hChaMP和生物反應器設計。(a)hChaMP模型橫切面(正面)為灌注腔內。(b)生物3d打印的hChaMP。(c)生物 反應器模型，生物反應器的側視圖，包括頂部和底部部分(上)和底部部分的自頂向下視圖(下),底部部分為hChaMP。
該設計允許灌注hChaMP 內部(實箭頭),以及圍繞hChaMP 外部的流體流動(虛線箭頭)。hChaMP 輕輕放置在細水平桿上 ,允許在hChaMP底部周圍進行外部灌注。(d)3d 打印生物反應器，由螺母、螺栓和硅膠墊圈組裝而成。(e)生物反應器 中的hChaMP。油管將hChaMP連接到生物反應器。(f)整個灌注裝置，生物反應器連接到泵和介質儲存器。
2.2. hChaMP 灌注
在SOLIDWORKS中設計生物反應器，其中hChaMP內部灌注端口(Ini和Outi)和hChaMP外部流動端口(Ine和Oute)(圖1(c))。生物反應器通過Perfactory IV數字光投影打印機(EnvisionTEC)使用E-shell 300 (EnvisionTEC,cat#1500300)進行3d打印(圖1(d))。灌注時，使用Masterflex L/S標準數字驅動器(cat#07522-30)與Masterflex L/S 14鉑固化硅膠管(1.6 mm ID, cat#96410-14)。培養基儲液器是一個50 ml的錐形管，蓋子上有三個孔，兩個用于流體的進出口，一個用于0.22μm注射器過濾器(Whatman, cat#6780-2502)，允許在培養基中進行無菌氧氣交換。培養基儲層最初填充兩倍體積的培養基(mTeSR Plus [STEMCELLTechnologies, cat#100-0276])，并添加100 μml – 1青霉素，100 μ ml – 1鏈霉素[penp -strep;Thermo Fisher Scientific, cat#15140122]用于灌注的第一天)，而不是管道和生物反應器中所需的系統。這樣，在隨后的日子里，只需簡單地更換錐形管，就可以更換 50%的培養基（mTeSR Plus，no pen-strep），從而最大限度地減少排空管道時可能發生的污染和氣泡形成。靜態對照在具有等量培養基的立式T25燒瓶中培養，每天也更換50%的培養基。
打印1天后開始灌注。生物反應器在生物安全柜中紫外線照射下，70%乙醇浸泡30分鐘滅菌。然后用無菌的1X PBS洗滌生物反應器三次。為了準備hChaMP進行灌注(圖S1)，將hChaMP移至有溫DPBS的培養皿中。硅膠管(15mm長，2mm內徑，3mm外徑;將uxcell (cat#a19011600ux0295)插入hChaMP的兩條血管中。將插入管的hChaMP移至干凈、干燥的培養皿中，在管和hChaMP的界面處移液無菌的20% GelMA(含0.5% w/v LAP，如上所述溶解于mTeSR1和乙酸中)，同時用藍光交聯。將hChaMP移動到充滿DPBS的生物反應器中，使用無菌細齒鉗將管的另一端插入生物反應器通道中(圖1(e))。20%的GelMA被添加到每根油管的兩端，以形成防止泄漏的密封。Outi的管(Masterflex C-Flex管，3.2 mm ID，編號06422-04)充滿DPBS，并連接到生物反應器上，以消除Outi的表面張力，這種張力會產生壓差，阻礙hChaMP的灌注。為了檢查內部灌注是否有泄漏，用食用色素染色的DPBS(通過0.22μm過濾器過濾)用注射器和針頭注射到Ini。如果油管連接處存在泄漏，則使用20%以上的GelMA。染色的DPBS用mTeSR Plus溫水沖洗。然后將生物反應器連接到灌注裝置上。將生物反應器連接到引管上，在生物反應器上放置30mm硅膠墊片，并用螺母和螺栓固定生物反應器蓋。將泵打開至3ml min – 1，以去除生物反應器中剩余的空氣。將灌注設置(圖1(f))移至培養箱(37℃，5% CO2)，并將流量改為間歇，每15分鐘以3ml min – 1的速度流動15 s。每天進行50%的介質更換，直到灌注結束。
2.3. 計算模擬
為了建立 hChaMP 中流體流動的計算模型，在生物反應器的入口和出口處測量了流動下的壓力。簡言之，如上所述，將無細胞 hChaMP 插入生物反應器并連接流動。在生物反應器入口或出口的底部放置止血閥（Qosina，cat#80395），以便在設置中插入壓力導管。使用 ADV500 PV系統和 1.4 Fr 壓力導管（Transonic）測量壓力曲線，數據采集采樣率為 5000 Hz。在Simvascular中使用流固相互作用(FSI)方法來解析內部流動[28]。根據實驗結果，采用彈性模量為1.96 kPa的新hookean模型來描述墻。流體模型采用牛頓流體模型，粘度為1 cP，用波形描述進口的間歇流動，并在出口施加與實驗結果相匹配的壓力作為邊界條件。為了穩定系統中的壓力，在明尼蘇達超級計算研究所進行了十個周期的模擬。外部流動使用Ansys Fluent, release 20.1進行求解，假設墻壁是剛性的。與內部流動模擬一樣，將流體描述為粘度為1 cP的牛頓流體，并施加一個波形作為進口邊界條件，其流量與內部流動模擬的出口結果相匹配。出口設為零參考壓力。
2.4.冷凍切片和免疫熒光(IF)染色
培養7天后，去除hChaMP底部(頂端)進行核糖核酸(RNA)提取(見下文)。剩余的hChaMP在4℃下用4%多聚甲醛固定過夜。第二天，hChaMPs用1X PBS洗滌三次。hChaMP腔室(在血管和切除的頂點之間)被切成兩部分，以便從結構的不同區域進行切片。切片前，樣品在30% w/v蔗糖的PBS中4?C孵育2 d。為了準備冷凍樣品，將樣品移動到30%蔗糖:O.C.T.的1:1混合物中化合物(Tissue-Tek，編號25608-930)孵育1.5小時，然后在O.C.T.化合物中低溫模孵育3小時。然后將樣品在-80℃下冷凍。使用徠卡CM1900低溫恒溫器對樣品進行10μm厚度的切片。將載玻片置于室溫下過夜，第二天使用或移至- 20℃。為了通過hChaMP成像細胞分布，切片用5μg ml?1 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI, Invitrogen, cat#D1306)染色8分鐘，然后用DAPI/1,4-重氮雜環[2,2,2]辛烷(DABCO;Sigma-Aldrich, cat#D27802)在甘油和PBS。在徠卡DMi8熒光顯微鏡下，將載玻片成像為瓦片。為了量化ImageJ中的菌落密度，使用瓦片掃描明場圖像跟蹤切片的邊緣，將dapi標記的瓦片掃描進行二值化，并使用Analyze Particles功能識別大于或等于1000μm2的細胞菌落。每個hChaMP分析了5個切片。通過在明場切片(菌落不容易可視化的地方)上沿著每個切片的厚度(從室外到室內)繪制10條線來定量分布，然后沿著每條線找到二值化DAPI的Plot Profile。在Microsoft Excel中分析剖面，以確定在組織厚度的每五分之一段內發生的情況。平均壁厚計算為所有線的平均長度。對于IF，用0.2% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, cat#T8787)滲透1小時，用5%牛血清白蛋白、1%甘氨酸、2%山羊血清和0.1% Triton X-100 (BGST)的溶液阻斷2小時。在BGST中，一級抗體(1μg ml-1小鼠anti-OCT3/4 [Santa CruzBiotechnology, cat#sc-5279]， 5μg ml-1小鼠anti-KI67 [BD Biosciences, cat#556003]，和2.5μg ml-1兔 anti-PAX6 [Invitrogen, cat#42-6600]，圖S2)在4℃下在切片上孵育過夜。在次級抗體(4μg ml-1?AlexaFluor 647羊 anti-mouse[Invitrogen, cat#A21236]或AlexaFluor 647羊anti-rabbit [Invitrogen, cat#A32733])中孵育2小時前，用0.2% Tween-20 (Millipore, cat#655204)在1XPBS中洗滌2次，用1XPBS洗滌1次。樣品再次用Tween-20和PBS洗滌，然后用DAPI染色，并如上所述用DAPI/DABCO涂載。采集菌落20×圖像，在ImageJ中定量熒光標記面積。具體來說，DAPI圖像是二值化的，并且使用AnalyzeParticles特征來跟蹤集落邊界，作為集落小于1000μm2的感興趣區域(roi)。然后對相應的IF圖像進行二值化處理，將每個ROI內標記物覆蓋的面積量化歸一化為相應ROI內的DAPI密度。對于每個標記，每個hChaMP分析了>30個菌落。
2.5. RT-qPCR
用刀片輕輕去除hChaMPs的頂端，并在液氮罐中快速冷凍，以備將來提取RNA。樣品裂解并使用PureLink RNA Mini Kit (Invitrogen，編號12183018A)分離RNA。使用Gen5軟件在Cytation3成像閱讀器(BioTek)上定量RNA的質量和數量。cDNA使用SuperScript IV VILO MasterMix (Invitrogen, cat#11756050)根據制造商的說明創建。逆轉錄定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)使用PowerSYBR Green Master Mix (1X,Applied Biosystems, cat#4367659)在RocheLightCycler 96(多能性標記，60°C退火)或Eppendorf Mastercycler ep realplex2(胚層標記，55°C退火)上進行30個循環。標記物的表達被標準化為GAPDH。引物序列來源于文獻(Integrated DNA Technologies，表S1)，并根據primer-blast[29]中所關注基因的特異性和低二聚化可能性，根據Integrated DNATechnologies 的 OligoAnalyzer Tool 選擇引物對。陽性對照的hipsc衍生的胚層組織如補充信息中所述。
2.6. 統計
每種情況下測試三個hChaMPs。在JMP Pro16.0中進行樣本組比較。對不相等均值(雙尾)的零假設計算p值，置信區間為95%。采用學生t檢驗計算靜態和灌注hChaMPs的p值，而RT-qPCR的多個條件采用方差分析(ANOVA)檢驗和事后Tukey-Kramer誠實顯著性差異(HSD)檢驗進行比較。
3.1. 生物反應器的設計與灌注參數的選擇為灌注設計的hChaMP結構如圖1(a)所示(視頻S1)。該結構在先前報道的結構[5]基礎上進行了修改，作為單個心室，允許未來通過施加流體流動和機械閥驅動來建模心室功能(即泵送)。hChaMP是通過擠壓打印的生物打印(圖1(b))，由含有hiPSCs(1500萬ml – 1細胞)、明膠甲基丙烯酰(GelMA)、甲基丙烯化膠原蛋白、層粘連蛋白/腸動蛋白和纖維連接蛋白的生物墨水形成。由于ecm支架的微妙性質，其存儲模量為1.79±0.13 kPa(圖S3)，因此設計了一個生物反應器來支持hChaMP在整個灌注過程中(圖1(c) – (e))。短管被用作hChaMP和生物反應器之間的連接。將管插入hChaMP中，在連接處加入無菌的20%GelMA并光交聯以將管密封到位。該生物反應器包含一個隔間，用于穩定定位hChaMP，并具有兩個通道，用于插入連接到hChaMP的管道。生物反應器被設計成適當地引導流體通過hChaMP的內部，然后繞過外部(圖1(c)和視頻S2-S3)，以最大限度地實現營養交換。為了減少通過hChaMP的流體阻力，Outi比Ini大。從Outi流出的水流流入Ine, Ine進入hChaMP下方的生物反應器隔間，并從hChaMP上方的蓋子流出Oute(圖1(c)和視頻S3)。在完成提供內部和外部流動的生物反應器設計后，考慮灌注流速。每30-60分鐘灌注1分鐘，這種不頻繁的灌注方式導致細胞生長很少，可能是由于生物反應器和hChaMP內缺乏氧氣交換以及廢物去除有限。因此，采用每15分鐘15 s的間歇灌注。這種流動的持續時間允許在hChaMP內部完全改變介質，并且頻率支持組織內的細胞存活。
圖2所示。流體流動特性。(a)，(b)通過顆粒跟蹤(a)和計算流體動力學(b)總結了hChaMP腔室的流動模式。(c)計算模型提供了灌注對hChaMP內壁速度、壓力和壁面剪切應力的影響。(d) hChaMP外部的流動概況，用藍色食用色素染色的DPBS進行演示。相對于流經hChaMP內部的流體，外部的流體流動速度較慢。(e) hChaMP外周流場計算模型。(f)由外部流體流動引起的壓力和壁面剪應力的計算近似值(此處流動方向為從左到右)。
值得注意的是，在生物反應器中對hChaMP施加壓力增加的情況下，泄漏將持續發生在管道-hChaMP界面。這種壓力限制限制了該模型在下游應用中的實用性，因為當接口處存在泄漏時，hChaMP無法達到更高的壓力。因此，我們探索了提高軟組織對疏水管粘附性的方法。經3-(三甲氧基硅基)甲基丙烯酸丙酯預處理(補充方法，圖S5(a))，油管與添加在油管- hchamp界面的GelMA的結合得到改善。這使得界面可以承受更高的壓力，hChaMP本身在破裂前的最大壓力達到16.8±0.6 mmHg(圖S5(b)， (c)和視頻S4)。這是系統使用蠕動泵(~ 8.2 mmHg)時的平均壓力的兩倍。然而，這個最大壓力或“爆裂”壓力被發現低于蠕動泵施加的最大壓力(~ 27.1 mmHg)。這種差異可歸因于蠕動泵的振蕩壓力，其中低壓和高壓的快速波動導致hChaMP的膨脹和收縮(視頻S3)。在爆炸試驗中，壓力被緩慢地直接施加到hChaMP壁上，導致結構不斷膨脹(圖S5(b)和視頻S4)，直到壁上變得太弱而無法容納更多的流體。
3.2. 流體流動參數的近似值
為了近似計算流體流動對hChaMP的影響，特別是在hChaMP壁面處的壓力和剪切應力，進行了計算模擬。將壓力導管插入Ini或Outi底部的止血閥，測量hChaMP入口和出口的壓力分布。在計算模型中，將測量到的壓力剖面的最大值、最小值和平均值作為hChaMP流動的輸入。SimVascular svFSI求解器是一款專門用于心血管模擬的開源軟件[28]，用于求解hChaMP的內部流動曲線。該軟件之前已經在體外模型中進行了驗證，并證明了其在描述流動動力學方面的有效性[30]。使用該軟件和hChaMP的3D模型，流體流動曲線與體外實驗的結果相匹配(圖2(b)、S4和視頻S2)，證實了該模型復制系統的能力。這允許計算在hChaMP內壁上產生的剪切應力，這是干細胞培養的一個關鍵參數。
發現hChaMP內的壓力相當均勻，在單個泵循環中的變化與實驗值相匹配，平均約為4.5-5.3mmHg，最大值為25.5 mmHg(圖2(c))。壓力在其最小值為負，反映了在泵的脈動循環中所看到的情況。在灌注數天后，這種壓力的變化似乎沒有引起hChaMP完整性的問題。壁面剪切應力變化較小，平均值約為1.0 dyn cm-2，在大部分hChaMP腔室中最大值為2.7 dyn cm-2，盡管在Outi附近隨著流體流出腔室急劇增加，達到15.0 dyn cm-2(圖2(c))。
由于外流存在復雜的幾何形狀，采用AnsysFluent求解外流廓線。Fluent是開源軟件SimVascular的商業替代品，已被廣泛用于心血管系統的流體流動模式演示，包括體外模型[31]。求解了外流動廓形，實現了hChaMP外壁面剪應力的計算。外部的壓力和壁面剪切應力要低得多，這可能是由于生物反應器的大隔間尺寸和從Outi到Ine的壓力下降，導致hChaMP周圍的流量較低(圖2(d) – (f))。
有趣的是，外部的壓力取決于所分析的位置。流體首先與hChaMP接觸的下側最大壓力高于上側;然而，兩者的差別相當小，底部的最大壓力為1.13 × 10-4?mmHg，上部的最大壓力為1.05× 10-4?mmHg。與內部流動的壓力相似，hChaMP外部的最小壓力略為負，但在10 – 6 mmHg的量級上。墻體剪應力也遠低于內部，范圍在10-7 -10-5?dyn cm?2之間(圖2(f))。總體而言，內壁剪切應力與干細胞擴增的普通生物反應器的剪切應力范圍相似，而外部剪切應力遠低于其值，據報道約為0.7 – 2.5 dyn cm-2[32-34]。此外，發現水凝膠中嵌入的干細胞能夠承受大于30 dyn cm-2的應力[22]，這表明我們設置的剪切應力近似于hiPSC擴增是合理的。
3.3. 灌注對hiPSCs生長和分布的影響為了確定流體流動對hiPSC增殖和分布的影響，在打印后1 d將hChaMPs插入生物反應器中進行灌注，使細胞有時間附著在結構上(圖3(a))。隨后的每一天，錐形管作為介質儲存庫替換為新鮮介質。油管中的介質，大約相當于系統中總體積的一半，沒有被排干，以防止污染或氣泡進入系統。因此，每天使用mTeSR Plus更換50%的培養基。隨著組織工程中的生物制造技術變得越來越復雜，污染風險也隨之增加。然而，干細胞一般避免使用抗生素，即使是短期治療也是如此[35]。在這里，青霉素鏈霉素在灌注的第一天加入，并在隨后的培養基更換中逐漸稀釋。在這種情況下，短期暴露于青霉素-鏈霉素對三維培養中單一化hiPSCs的增殖和效力沒有影響（圖S6）。
圖3所示。灌注可改善hiPSC菌落的覆蓋和分布。(a) hChaMP增殖時間線，打印后第1天開始間歇灌注。(b) hChaMP橫 截面，用DAPI染色(白色)顯示培養7 d后，灌注或不灌注時整個hChaMP的細胞密度。(c)與靜態對照相比，灌注樣品中 hChaMP中的菌落密度增加了一倍。(d)間歇灌注不影響壁厚。(e)在hChaMP細胞壁上劃線，在ImageJ中進行處理，確定 菌落在細胞壁上的分布。灌注后的hChaMPs與靜態hChaMPs相比，壁中部的菌落明顯增加。在組織壁各區域進行靜態和灌注hChaMPs的比較。n?= 3 hChaMPs。統計上不顯著;#p?< 0.1，*p?< 0.05，**p?< 0.01)。
圖4。hiPSCs在灌注后仍能保持多能性和增生性。(a)、(b)灌注后的hChaMPs細胞中，OCT3/4 (a)和KI67 (b)的表達仍 然很高，與靜態對照細胞相當。n = 3個hChaMP，每個hChaMP >30個菌落。(c) RT-qPCR證實，與陰性(hiPSC)和陽性對照(hiPSC衍生的中胚層、內胚層或外胚層)相比，多能性標記物OCT4、NANOG和SOX2的高表達和胚層標記物的低表達相對于GAPDH的表達。(d) PAX6蛋白在靜態和灌注hChaMPs中均未表達，但在胚層陽性對照中表達較低。運動神經元(分化第12天)作為參考，高水平的熒光信號對應于PAX6的高表達。不重要的;*p < 0.05,**p < 0.01,***p?0.001,****p < 0.0001)。
hChaMPs流式培養6天，打印后總培養時間為7天，然后固定并冷凍切片分析。DAPI染色(圖3(b))用于確定活細胞菌落的大小和位置。在之前的工作中(圖S7)，我們發現不屬于菌落一部分的細胞是不可存活的，因為它們可能在制造所需的單化過程中死亡，并且仍然被包裹在工程組織中。基于這些標準，我們發現灌注結構的hiPSC菌落密度相對于靜態培養基中的對照組增加了1.9倍(圖3(c))。對切片組織進行檢查，以驗證流動對hChaMP完整性沒有影響。靜態和灌注的hChaMPs保持一致的壁厚，約為1.2-1.4 mm(圖3(d))。
此外，與靜態培養的hChaMPs相比，灌注hChaMPs改善了hiPSC菌落在細胞壁內的分布(圖3(e))。灌注的hChaMPs中，大多數hipsc位于組織壁的中部，在組織壁的不同區域間菌落數量變化較小。另一方面，靜態對照的菌落位于hChaMP外側附近，在整個組織中的分布較少。有趣的是，灌注和靜態hChaMP在hChaMP最外層的菌落百分比相對于下一個內部部分都要低。這可能是由于在支撐槽移除和介質改變或灌注過程中細胞丟失所致。3.4. 灌注對hiPSC多能性的影響為了測試來自流體流動的剪切應力是否會導致hiPSCs的不良分化，對hChaMPs的冷凍切片進行OCT3/4 IF染色(圖4(a))。集落的定性和定量分析表明，幾乎所有細胞都保持多能性，多能性與靜態對照相當。此外，細胞高度增殖，KI67在整個菌落中呈陽性表達(圖4(b))。這表明hipsc在間歇灌注后仍保持其多能性和自我更新特性。接下來，使用RT-qPCR來量化多能性標記，以及來自每個胚層的標記，以在轉錄物水平上確認我們的結果(圖4(c))。與2D培養的hiPSC對照相比，在靜態和灌注狀態下，OCT4、NANOG和SOX2的表達均保持較高水平。總的來說，除了一個例外，沒有檢測到胚層標記物，或者發現相對
于hiPSCs或靜態hChaMPs的水平不顯著。外胚層標志物PAX6在灌注hChaMP細胞中的表達高于2DhiPSCs (p=0.044)。然而，IF染色顯示PAX6在hChaMPs中沒有蛋白水平的表達(圖4(d))。
生物反應器的開發是一個反復的過程，成功增殖的最重要參數是對軟水凝膠的精細處理和連接處的防泄漏，以確保通過hChaMP內部進行灌注。早期嘗試以垂直、直立的姿勢灌注hChaMP，成功地提高了細胞在內部的活力。然而，難以設置hChaMP進行灌注，并且需要一個小的隔間尺寸來保持hChaMP，最大限度地減少了hChaMP周圍的營養物質體積，使得這些生物反應器設計不切實際。因此，目前的生物反應器設計將hChaMP放置在仰臥位置，為養分交換提供了簡單的設置和足夠的培養基體積。精細的操作仍然是灌注成功的關鍵。在hChaMP打印分辨率較差的情況下，管子插入變得更加困難，需要更嚴格的處理，導致培養第7天菌落形成急劇減少。此外，壓差在確保通過hChaMP內部灌注方面發揮了重要作用。設計初期的一個常見問題是hChaMP油管連接處的泄漏，盡管添加了GelMA來形成密封。我們發現，在灌注前，必須在Outi處連接充滿DPBS的油管，以消除表面張力，這種張力會產生壓差，阻礙hChaMP內部的灌注，導致連接處泄漏。再加上Outi相對于進油管尺寸的增加，從本質上解決了這個問題，促進了流體通過hChaMP內部的流動。翻譯生物打印方法的一個很大的限制是需要大量的細胞達到生理密度，當工程組織的大小增加到生理尺度時，這一點尤為重要。允許細胞在原位增殖減少了對大量孔板和相應的單層擴增介質體積的需求。在這里，只需要一個6孔板(1000萬個hiPSCs)就可以產生厘米級的hChaMP。進一步優化培養時間、打印時的細胞密度，或調整ROCK抑制劑和/或類似的生化化合物處理，可以進一步增加分化前的hiPSC密度。增加培養時間可能會允許進一步的細胞生長，但不適合擴大規模和組織應用。這也可能進一步影響基因表達。在培養的第7天，多能性和胚層標記物在RNA水平上幾乎沒有變化，但灌注的hChaMPs中外胚層標記物PAX6略有增加。在蛋白水平上，PAX6未在hChaMPs中表達。這一結果與暴露于0.003 – 5 dyn cm – 2剪切應力下的小鼠PSCs的研究一致，其中神經標記物的表達與靜態培養相當[41,42]。與2D培養的hiPSCs相比，灌注的hChaMPs中NANOG RNA表達也有輕微但不顯著的增加。有趣的是，最近的一項研究發現，在暴露于流動的小鼠iPSCs中，NANOG和OCT4的表達也有類似的增加，這可能是由于涉及E-cadherin和/或β-catenin的機械轉導[43]。此外，在人類多能干細胞中，NANOG被認為可以抑制外胚層的形成[44]，并通過調節進入細胞周期的s期來增加細胞增殖[45]，這表明NANOG可能在灌注的hChaMPs中發揮有益作用。因此，需要進一步的研究來確定長時間灌注對hiPSCs的影響。生物墨水中的細胞密度可能會進一步優化以增加菌落數量，但正如所討論的那樣，這受到用于打印的噴嘴尺寸的限制。另外，用10μM ROCK抑制劑Y-27632或法舒地爾治療多日可提高干細胞增殖率，s期細胞比例增加[46]。同樣，類黃酮3,2 ‘ -二羥黃酮(3,2 ‘ DHF)已被證明可以增加hiPSCs的增殖、s期細胞的百分比和細胞內谷胱甘肽的表達[47]，這可能在細胞增殖的表觀遺傳調控中發揮作用[48]。與單獨使用任何一種分子相比，3,2 ‘ -DHF和Y-27632聯合處理hiPSCs進一步改善了增殖[47]，這表明有希望的方法可以與灌注結合進一步改善細胞密度和組織厚度。在hChaMP中獲得所需的hiPSC密度后，下一步將是分化。先前的研究表明，在剪切作用下，有可能分化為中胚層[49-52]、內胚層[53,54]和外胚層[51,55]。此外，考慮到剪切應力在胎兒發育中的作用[56-59]，仿生血流可能有利于分化組織的功能。然而，在某些分化情況下，高水平的剪切應力是有害的。例如，Ting等人發現，在心肌細胞分化過程中，在搖椅上持續攪拌導致心肌細胞非常少;然而，與靜態培養相比，間歇性攪拌可使分化效率提高約38%[49]。同樣，在微載體的肝臟分化中，在分化的早期階段，超過30 rpm的攪拌會導致細胞脫離微載體[54]。因此，生物反應器中的分化參數需要針對所需的組織類型進行優化，以平衡營養輸送/廢物清除和維持細胞健康。作為誘導多系分化進展的方法，原位hiPSC增殖的效用可以進一步增強[60-65]。這種方法，從不同的支架材料特性到改變細胞因子或培養基成分以及基因工程hiPSCs，可以很容易地轉化為生物打印和生物反應器設置，以獲得大量不同類型的細胞。分化為多種組織類型，可以研究發育過程中相關組織的形成，疾病進展中不同組織之間的串擾，或各種治療方法和劑量對各種器官的潛在影響。例如，起搏器和心室心肌細胞的空間分化將極大地增強藥物篩選研究，提供對給定治療的心律和泵功能的見解。纖維母細胞、免疫細胞或神經細胞的摻入也可以進一步增強仿生功能。
同樣，許多組織工程研究現在都集中在結合血管的方法上，以增加營養供應和可能的組織厚度。然而，在我們的實驗中納入內皮細胞和其他相關細胞類型可能會導致不必要的旁分泌信號，從而影響打印組織中干細胞的多能性或分化效率[66]。在分化為所需的細胞類型后，內皮細胞可以被納入像我們這樣的模型中，其中灌注可以進一步實現對內皮重要的機械轉導[67,68]，并可能誘導血管生成[69]。血管的存在將允許營養輸送的增加，從而進一步開發工程組織的效用。
生物3D打印領域的最新發展極大地擴展了創造復雜的、與生理相關的體外組織的潛力。當這些組織由人類來源的細胞形成時，所產生的模型可以提供對疾病機制、進展和治療的增強研究，作為動物模型的補充。在這里，我們利用介質灌注和3d生物打印室結構中hipsc的高增殖能力，實現了生成厚組織模型的目標。總的來說，我們預計，隨著該領域在創造更復雜組織方面的發展，特別是與正在開發的工程策略相結合，這種在這種模型中擴展hipsc的能力將是重要的。在該模型中看到的連續的hipsc集落的形成將允許各種組織類型的原位分化，以便生成具有更高功能和一致性的組織，從而可靠地進行體外建模。
數據可用性聲明支持本研究結果的所有數據都包含在文章中(以及任何補充文件)。
致謝我們感謝Jeffrey Ai幫助重新設計用于灌注的hChaMP結構，Aimee Renaud生成外胚層陽性對照，Victor Garcia獲得hChaMP、生物反應器和裝置的圖像，以及明尼蘇達大學實驗外科服務部門幫助測量破裂壓力。我們感謝我們的資金來源，美國國立衛生研究院T32GM008347 (ERK)，R01HL137204 (ERK, WL和BMO)和NIBIB/NIH工程復雜組織中心P41 EB023833，以及美國心臟協會905669 (ERK)。
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