摘要
為了提高體外皮膚組織模型的物理相關性和可翻譯性，增強其結構復雜性是非常重要的。通過使用3D生物打印技術和合適的生物墨水，可以調節真皮和表皮的結構并將細胞和材料精確地沉積在所需的位置。在本研究中，使用BIO X生物打印全厚度皮膚組織模型。真皮使用原代真皮成纖維細胞嵌入GelXA skin bioink進行生物打印，表皮含有高濃度角質形成細胞嵌入ColMA，沉積在真皮頂部。皮膚模型總共培養了14天，在開始氣液界面培養的第6天和培養的第14天結束時收集了樣品。第1類人膠原蛋白（角蛋白14）的免疫熒光染色，角蛋白10和絲蛋白表明，所有標記物的表達均隨時間增加。真皮中的膠原蛋白網絡得到加強，并且表皮中的角質形成細胞明顯地自我重組：隨著大量的絲聚蛋白向表皮的外層移動，在角質形成細胞中角質蛋白10急劇增加。這些結果表明，強健的皮膚組織模型可以通過3D生物打印來創建，從而驗證了該技術在該領域的適用性。
引言
皮膚是我們與外部環境的第一個也是主要的界面，是極具吸引力的再生器官，并且在過去40年中科學家們對其進行了大量探索（Loai，2019; Tarassoli，2017）。 部分原因是皮膚組織模型的廣泛應用領域，從藥物篩選到化妝品測試以及傷口愈合研究，部分原因是皮膚組織的組成相對簡單，可以分為兩層，每層具有一類主要的細胞類型?這種簡單構成意味著過去已經建立幾個2D模型和培養系統。 但是，這些模型無法完全概括天然皮膚，并且缺乏3D模型提供的空間組織（Loai，2019; Singh，2020; Vijayavenkataraman，2016）。 為了增加物理相關性并增強體外結果與體內條件的可翻譯性，迫切需要以3D方式調制皮膚組織模型。
在開發用于構建3D皮膚模型的不同技術中，生物打印制造方法在克服與組織建模有關的挑戰方面已顯示出廣闊的前景（Pati，2016; Singh，2020），由于使研究人員能夠精確地模擬所需的結構，并根據需要自由地結合不同的細胞和材料。 關鍵是要使用合適的基質配方，以便打印出穩定的三維結構，支持細胞增殖和遷移，同時確保結構的穩定性和機械完整性?(Tarassoli, 2017; Vijayavenkataraman, 2016)。
在3D生物打印中，天然和合成生物材料相結合形成可打印的生物墨水。 天然生物材料的好處是可以減輕環境對細的影響，而合成生物材料具有更好的機械性能（Murphy，2014年）。 3D生物打印中使用的兩種最常見的天然生物材料是明膠和膠原蛋白。 膠原蛋白是人體中最豐富的蛋白質，是細胞外基質（ECM）的關鍵角色，可促進出色的細胞通訊（Kular，2014年）。 但是，純膠原蛋白很難處理，因為必須將其保持在4°C或酸性以避免固化。
明膠，源自膠原蛋白，所以保留了膠原蛋白的一些細胞特征，但具有在室溫下為固體而在體溫下為液體的化學優勢。甲基丙烯酸明膠（GelMA）是一種可印刷的生物墨水，可在27°C下使用光進行交聯，從而誘導甲基丙烯酸酯基團之間形成共價鍵。 與甲基丙烯酸酯基團的交聯性的相同特征也可以添加到膠原蛋白中。 但是，甲基丙烯酸膠原蛋白（ColMA）仍需要在4°C下處理以避免固化。 這項研究中使用的GelXA生物墨水是由CELLINK開發的基于GelMA的生物墨水配方，旨在擴大GelMA的可印刷性范圍，并易于形成復雜的3D結構。要了解有關不同生物材料和生物墨水特性的更多信息，請查看我們的生物墨水選擇指南手冊或訪問我們的網頁。
在這項研究中，我們旨在使用BIO X生物打印機打印出具有真皮和表皮的全厚度皮膚組織模型，GelXA SKIN生物墨水用于真皮，ColMA生物墨水用于表皮。在GelXA皮膚上，真皮的3D結構被牢固地生物打印出來 ，而ColMA的固有特性可以形成薄而豐富的表皮層。 在真皮中，重點是評估ECM的產生，特別關注1型膠原的產生，因為它是天然真皮的主要蛋白質。
對于表皮，選擇了三種分化標記：用于增殖性角質形成細胞的角蛋白14（K14），用于區分角質形成細胞的角蛋白10（K10）和作為凝集層標記的絲聚蛋白。 天然皮膚的表皮具有明確的分化過程，其中附著在真皮上的增生角質形成細胞在皮膚最外層變成角質細胞（角質化角化細胞）（Eckhart，2013）。 在此角質化過程的不同層中，表達了特異性分化標記（圖1）。 為了評估表皮的發育，我們選擇評估指示標記的表達。
圖1.天然表皮的成角過程（Eckhart，2013年）。
材料和方法
細胞準備
皮膚組織模型中使用了兩種細胞：少年正常人皮膚成纖維細胞（NHDF，C-12300，PromoCell）和少年正常人皮膚表皮角質形成細胞（NHEK，C-12001，PromoCell）。 按照PromoCell的擴增方案（NHDF，NHEK）對細胞進行2D擴增后再進行生物打印，并分別用于第6-7代（NHDF）和第3代（NHEK）。 NHDFs在添加有生長培養基SupplementMix（C-39315，PromoCell）的成纖維細胞生長培養基（C-23010，PromoCell）中培養，而NHEK在PromoCell的角質形成細胞生長培養基的發育配方中與培養基SupplementMix（C-97294， PromoCell）； 兩種培養基均添加了1％的抗生素-抗真菌藥（Gibco，100x）。
皮膚組織模型的生物打印
皮膚組織模型被設計為真皮籃，其實心底層上覆有兩個網格層和6層高帽檐（圖2）。 這是為了促進種子后表皮的包裹。 用GelXA SKIN（CELLINK，Ref＃IK3X21110301）對皮膚籃子進行生物打印。 簡而言之，收集了5.7 x 106 NHDF，旋轉并重組為250 μL細胞懸液，然后將其小心地混入2.5 mL GelXA SKIN中，預熱至37°C，然后轉移到琥珀色濾芯中（CELLINK，參考編號CSO010311502）。為了除去殘留的氣泡，將帶有嵌入式NHDF的GelXA SKIN濾芯在460G下離心1分鐘。 然后，在開始打印會話之前，將墨盒安裝在溫度控制的打印頭（CELLINK，參考號＃00000020346）上，然后在準備好的BIO X生物打印機中溫度設置成24°C，持續10分鐘。
進行該步驟需要將GelXA生物墨水的溫度平衡到24°C，這是適用于復雜結構的GelXA生物墨水的合適生物印刷溫度。
然后真皮籃在24°C下用溫控打印頭以4至5 mm / s的速度，20至40 kPa的壓力在12孔板中對進行生物打印，并將BIO X的打印床設置為 14℃。 然后先用405 nm光固化模塊在高于構造物5厘米處用405 nm光固化模塊將12個重復的真皮籃光固化15秒（每個構造物），然后浸入交聯劑（CELLINK，參考號CL1010006001）中，并補充10 U / mL凝血酶5分鐘。 然后將皮籃用成纖維細胞生長培養基洗滌一次，并在添加表皮之前與成纖維細胞生長培養基孵育（37°C，5％CO2）1小時。
圖2.培養14天后的3D生物打印模型的示意圖，側視圖（左）和頂視圖（中）以及生物打印的皮膚組織模型的圖像（右）。
表皮的添加
對于表皮，使用ColMA（CELLINK，參考號IK4501022001）和NHEK的混合物。簡而言之，將12 x 106?NHEK（每個皮膚籃1 x 106）重構為240 μL細胞懸液，并與240 μL ColMA（8 mg / mL，終濃度4 mg / mL）混合。將重構的ColMA置于冰上，直到將其添加到真皮結構中。從真皮籃中取出成纖維細胞培養基，并在每種真皮構建體的頂部添加40 μL表皮生物墨水-細胞混合物。在光固化30秒（405nm，距構建體5cm的距離）之前，將構建體在臺式上放置15分鐘以沉降。然后將樣品以10G離心10秒，再光固化30秒。這是為了增強表皮和真皮之間的接觸。然后將皮膚組織模型浸沒在角質形成細胞生長培養基中，并在37°C，5％CO2下孵育6天，然后轉移至氣液界面培養物中。通過將構建體轉移到補充有合適體積的角質形成細胞生長培養基的transwell插入物中來建立氣液界面（圖3）。每2至3天更新一次培養基。
圖3. A）生物打印的真皮籃子。 B）3D生物打印的皮膚組織模型轉移到Transwell插入物中。 C）從皮膚組織模型的浸沒培養到氣液界面培養的轉移的圖示。
分析
根據CELLINK的固定方案，在第6天（開始氣液界面）和第14天（實驗結束）收集樣品，并在4％PFA中固定以進行組織學染色。 然后將樣品包埋在石蠟中，并按照CELLINK的方案進行切片。 他們對人類1型膠原蛋白（Atlas抗體，Ref＃HPA011795，未報道發現可檢測大鼠來源的ColMA），角蛋白10（Atlas抗體，Ref＃HPA012014），角蛋白14（Abcam，Ref＃ab7800）和絲蛋白（Atlas）染色 抗體，參考編號HPA030188），遵循CELLINK的免疫熒光染色方案，并使用Alexa Fluor 488（ThermoFisher，參考編號A-27034用于兔子，參考編號A-11029用于小鼠）作為第二抗體。 樣品還按照CELLINK的H＆E染色方案進行了H＆E染色。 所有協議都可以在CELLINK的支持標簽下的網頁上找到。
結果與討論
用于該皮膚組織模型的制造方法創建了完整且堅固的構造，該構造在整個實驗過程中保持其形狀。 樣品橫截面的H＆E染色最初顯示，兩個隔層（真皮和表皮）之間的連接較弱。 但是在第14天，這兩層已經合并（圖4）。 在第14天，可以看到表皮平滑地沿著真皮的輪廓移動，并且角質形成細胞開始重組。
圖4.在第6天和第14天分別以4倍和10倍放大率對皮膚組織模型進行H＆E染色。 表皮在第6天圖像中位于右側，在第14天圖像中位于右上方。 比例尺200 μm（放大4倍）和100 μm（放大10倍）。
H＆E圖像中真皮的強烈染色使得很難將成纖維細胞從生物墨水基質中分離出來，但是從免疫熒光（IF）染色中，可以觀察到清晰的膠原網絡形成（圖5）。 膠原蛋白的表達已經在第6天出現，但是一直延續到第14天。成纖維細胞的數量在第14天也有所增加，表明真皮內成纖維細胞的增殖。 還對樣品進行了彈性蛋白染色，但是沒有彈性蛋白表達的跡象，表明該實驗中的條件有利于表皮的形成。 如果在較長的培養時間內成熟，則可以在模型中檢測到彈性蛋白。
仔細觀察表皮的發育，免疫熒光圖像顯示整個培養過程中都保持了角蛋白14的表達，而在第14天角蛋白10和絲聚蛋白的表達均增加。 在表皮的中部，而角蛋白層（角質層的標記）應在表皮的最外層。 角蛋白10和絲蛋白的表達明顯增加表明角質形成細胞已經開始分化。 在第14天，絲聚蛋白表達重新定位到構建體的頂部，朝向氣-液界面，顯示了細胞在生物打印模型內重組的能力。
圖5.在第6天和第14天用DAPI（藍色）復染的1型膠原蛋白（綠色），角蛋白10（紅色），角蛋白14（黃色）和絲蛋白（紫色）的免疫熒光圖像。 角蛋白10、14和絲蛋白圖像中圖像的左邊緣或上邊緣。 放大倍數= 10倍。 比例尺= 100 μm。 在一個會話中采集圖像以保持相同的采集參數。
在14天的培養期內，將構建體在最初的6天中浸入水下培養，然后轉移至氣液界面培養8天。 生物打印的皮膚組織模型顯示真皮和重組表皮中膠原蛋白的產生增加，傳統的分層分化模式開始形成。 穩定的角蛋白14表達（表明存在增殖的角質形成細胞）表明，有可能擴展模型的氣液界面培養，以進一步成熟生物打印的皮膚構造。
結論
這項研究舉例說明了如何使用原代細胞培養系統和CELLINK的3D生物打印平臺對全厚度的皮膚組織模型進行3D生物打印。
? PromoCell的細胞和培養基細胞培養系統可以創建全厚度皮膚組織模型。 在當前模型中，細胞重組并增殖以形成更天然的細胞結構。
? GelXA SKIN生物墨水為皮膚發育提供了良好的環境，基于ColMA的表皮生物墨水支持皮膚組織模型內的表皮形成。
? 模型設計為表皮和真皮發育形成了一個強大的平臺，在14天的培養期內保持穩定，但可以培養更長的時間，以使其他真皮和表皮標記物進一步成熟。
References參考文獻
DOI:10.1177/2041731414557112.
DOI:10.1038/nbt.2958.
