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2D培養(yǎng)和3D生物打印類腫瘤的藥物反應(yīng)對比

摘要
三維生物打印在癌癥研究中受到了廣泛的關(guān)注，其中迫切需要預(yù)測性和代表性腫瘤模型。這項研究調(diào)查了2D細(xì)胞培養(yǎng)和3D生物打印的腫瘤模型在評估乳腺癌和胰腺癌的侵襲性形式中的藥效的用途。用順鉑和吉非替尼治療2D和3D腫瘤模型，并比較細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞毒性的變化。順鉑和吉非替尼具有不重疊的作用 機(jī)制，分別干擾DNA修復(fù)機(jī)制和表皮生長因子受體（EGFR）信號傳導(dǎo)。我們的發(fā)現(xiàn)驗證了生物印制的類瘤是評估藥物功效的可靠模型，并顯示3D模型可實現(xiàn)相關(guān)的細(xì)胞形態(tài)和遷移模式，以及對抗癌藥物的獨特反應(yīng)，而這些反應(yīng)不同于傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。

介紹
在癌癥生物學(xué)中，腫瘤微環(huán)境（TME）是腫瘤細(xì)胞與免疫系統(tǒng)之間的關(guān)鍵戰(zhàn)區(qū)。TME是一整套細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），免疫細(xì)胞，信號分子，血管和成纖維細(xì)胞，可包裹腫瘤并影響癌癥進(jìn)展。TME的成分通過分 泌影響腫瘤行為各個方面的小信號分子而相互作用，這些分子包括細(xì)胞增殖，侵襲，轉(zhuǎn)移和抗癌治療的 耐藥性（Bremnes，2011年）。 因此，重建TME對抗癌研究至關(guān)重要，但主要的挫折是無法開發(fā)用于高通 量藥物評估的預(yù)測性3D腫瘤模型。 3D腫瘤模型應(yīng)概述腫瘤基質(zhì)中的細(xì)胞間相互作用，并克服2D細(xì)胞培養(yǎng) 系統(tǒng)的局限性。 在這里，3D生物打印為預(yù)測體內(nèi)結(jié)果，對TME建模和評估藥物反應(yīng)提供了一種有前途的解決方案。

轉(zhuǎn)移和化學(xué)耐藥性威脅著癌癥患者的生存。在癌癥管理領(lǐng)域已顯示出希望的一種治療方式是化學(xué)療法， 其使用小的抗癌分子攻擊特定的生長途徑并殺死癌細(xì)胞。此類分子中有順鉑（CIS）和吉非替尼（GEF） ，這是FDA批準(zhǔn)的分別靶向DNA和EGFR途徑的抗癌藥物。簡而言之，CIS通過抑制細(xì)胞分裂和mRNA的產(chǎn)生而導(dǎo)致凋亡，而GEF則干擾了癌細(xì)胞中EGFR信號的上調(diào)。有趣的是，雖然CIS和GEF都已用于治療胰腺癌和乳 腺癌的致死形式，但它們在體外也與假陰性或假陽性預(yù)測相關(guān)聯(lián)，表明它們在2D和3D中對細(xì)胞的影響不同（雷諾茲，2017）。為了進(jìn)一步解決這一差異，我們比較了CIS和GEF對使用2種乳腺癌（MCF7，MDA MB 231）和2種胰腺癌（BxPC3，Panc-1）細(xì)胞系的2D單層和3D生物打印類瘤的影響。

材料和方法
細(xì)胞準(zhǔn)備
從美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）購買了兩種胰腺癌細(xì)胞系（BxPC3，Panc-1）和兩種乳腺癌細(xì)胞系 （MCF7，MDA MB 231）。 按照供應(yīng)商的協(xié)議培養(yǎng)所有細(xì)胞系，每3至4天傳代一次。 BxPC3細(xì)胞在帶有L-谷氨 酰胺（Corning，參考號10-040-CV）的RPMI培養(yǎng)基中生長。 Panc-1細(xì)胞在含4.5g/L葡萄糖，L-谷氨酰胺和丙 酮酸鈉（Corning，參考號10-013-CV）的DMEM中生長。MCF7細(xì)胞在EMEM（BD，Ref＃670086）中培養(yǎng)； MDA和MDAMB 231細(xì)胞在不含L-谷氨酰胺（Corning，參考號10-045-CV）的無碳酸氫鹽的Leibovitz L-15培養(yǎng) 基中生長。所有培養(yǎng)基均補充有10％FBS（Gibco，目錄號16000044）和1％青霉素鏈霉素（Gibco，參考 號1509-70-063）。

生物墨水的制備和生物印刷
根據(jù)CELLINK規(guī)程準(zhǔn)備了3mg/mL的Coll1（CELLINK，Ref＃IK4000002001）和5％GelMA（CELLINK，Ref＃ IK3051020303）進(jìn)行生物打印。將總共3 mL的Coll1或GelMA與5×106細(xì)胞/100μL培養(yǎng)基混合（10：1），并分別裝入透明和琥珀色墨盒（CELLINK，Ref＃CSO010311502），以?3kPa進(jìn)行液滴打印。設(shè)置為8°C的溫度控 制打印頭（TCPH，SKU＃000000020346）和氣動打印頭分別用于在8°C打印床上生物打印Coll1和 GelMA液 滴。使用BIOX（CELLINK，SKU＃000000022222）上的液滴打印功能，將每種生物墨水打印在未經(jīng)處理的96孔 板（Thermo Fisher Scientific，目錄號267427）中。 印刷后，將Coll 1液滴在37°C下熱交聯(lián)20分鐘，然 后將GelMA液滴在365nm下進(jìn)行UV交聯(lián)6秒鐘。將100μL培養(yǎng)基添加到每個孔中，并每2至3天刷新一次。

2D單層培養(yǎng)
為了進(jìn)行2D比較，將每種細(xì)胞系接種到經(jīng)過處理的96孔板中（ThermoFisher Scientific，Cat＃167425）。 培養(yǎng)48小時后， 針對每種細(xì)胞類型優(yōu)化了細(xì)胞接種密度，以達(dá)到90％融合。 Panc-1細(xì)胞以1.2 x 104細(xì)胞/ 孔接種，BxPC3細(xì)胞以1.7 x 104細(xì)胞/孔接種，MCF7細(xì)胞以2.0 x 104細(xì)胞/孔接種，MDA MB 231細(xì)胞以2.0 x 104細(xì)胞/孔接種好。

藥物治療與分析
用不同濃度的吉非替尼（LC Laboratories，＃G-4408）或順鉑（Cayman Chemical Company）分別將生物打 印的類瘤和2D單層膜分別處理96小時和48小時。使用MTS分析（Sigma-Aldrich）和LIVE/DEAD染色試劑盒 （Invitrogen）評估2D和3D條件下的細(xì)胞活力。 所有測定均按照制造商的說明進(jìn)行。 使用EVOS Auto 2熒光 顯微鏡（Thermo Fisher Scientific）采集圖像。

統(tǒng)計分析
使用GraphPad Prism 8.2.1進(jìn)行統(tǒng)計分析。 所有數(shù)據(jù)均表示為六聯(lián)體進(jìn)行的兩個實驗的平均值±SEM。 使用 單向方差分析（ANOVA）分析治療條件的差異，并認(rèn)為p值<0.05顯著。

圖 1. 在第11天，生物打印的類瘤的相襯度和LIVE / DEAD圖像。優(yōu)化了Calcein-PI分析以進(jìn)行3D培養(yǎng)，并用于說明高濃度順鉑或吉 非替尼的細(xì)胞死亡。 該測定法的益處顯示了抗腫瘤藥對所有4種細(xì)胞系的強(qiáng)大作用，并描繪了每種細(xì)胞類型和ECM的細(xì)胞形態(tài)變化。 比例尺= 1000 μm或650 μm。 綠色=活著，紅色=死了。

結(jié)果和討論

生物打印類瘤中的球體形成和細(xì)胞形態(tài)
腫瘤會根據(jù)細(xì)胞類型和培養(yǎng)條件適應(yīng)不同的形態(tài)（Nath，2016年）。 在GelMA和Coll 1中培養(yǎng)7天后，癌細(xì) 胞已經(jīng)聚集形成各種形態(tài)的球體。 如圖1所示，MDA MB 231細(xì)胞形成同心的星狀網(wǎng)絡(luò)，MCF7細(xì)胞形成圓形 的球體，BxPC3細(xì)胞形成葡萄狀的橢圓體，而Panc-1細(xì)胞形成質(zhì)量球體。 由于孔隙度，剛度和組成的差 異，將GelMA和Coll 1用作腫瘤支架也會影響球體的形成。 有趣的是，在2D培養(yǎng)物中生長的癌細(xì)胞缺乏所 描述的形態(tài)，可能是因為它們?nèi)狈χС旨?xì)胞間相互作用，緊密連接以及營養(yǎng)和氧氣梯度的ECM（數(shù)據(jù)未顯 示）。

缺氧3D模型中
缺氧是藥物反應(yīng)的另一個變量，對于3D模型和體內(nèi)組織而言是唯一的。 Warburg效應(yīng)將缺氧描述為癌細(xì)胞 的生存模式，在該模式中，缺氧從產(chǎn)生氧氣和ATP轉(zhuǎn)變?yōu)樯险{(diào)EGFR和AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而促進(jìn)增殖。 此開關(guān) 增加了3D模型中的毒性，酸性和廢物堆積，從而創(chuàng)建了3環(huán)低氧梯度。 低氧梯度如圖1所示，其中朝向球體 中心的細(xì)胞似乎是死的（紅色），而邊緣周圍的細(xì)胞是可行的（綠色）。 由于廢物堆積和缺氧，最外面的 環(huán)是一層增殖細(xì)胞，中間的環(huán)是一層活細(xì)胞，而最里面的環(huán)是壞死細(xì)胞的核心（Nath，2016年）。

順鉑在2D和3D中的功效
在第2天和第7天分別將低劑量至高劑量的CIS添加到2D單層和3D生物打印的類瘤中。 2D單層治療持續(xù)48小 時，3D生物打印類瘤持續(xù)96小時。 MTS分析揭示了所有細(xì)胞系以及3D乳腺癌類腫瘤在2D單層中的劑量依賴 性細(xì)胞毒性（圖2A）。 有趣的是，BxPC3和Panc-1細(xì)胞系在3D中顯示的IC50高于2D。 換句話說，兩種胰腺 癌細(xì)胞系在3D生物打印的類瘤中均不受CIS影響。 在這里，一種解釋是胰腺癌細(xì)胞顯示出對增加的CIS濃度 有抗性（Wang，2016； Kelland，2007； Sangster-Guity，2011）。 響應(yīng)藥物治療，胰腺癌細(xì)胞可能已 經(jīng)誘導(dǎo)了它們的生存途徑，上調(diào)了衰老，DNA損傷反應(yīng)信號和跨病變DNA的合成（Gomes，2019）。

吉非替尼在2D和3D中的功效
?EGFR癌蛋白通常在乳腺癌和胰腺癌細(xì)胞系中過表達(dá)。 因此，藥物對EGFR途徑的抑制作用可導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，衰老或凋亡（Jacobi，2017）。 如圖2B所示，吉非替尼在3D和2D中顯著降低了細(xì)胞活力。 對于所有 細(xì)胞類型，3D Coll 1和GelMA的IC50均低于2D培養(yǎng)物的IC50，這表明GEF在3D生物打印類瘤中的死亡比2D培 養(yǎng)物中的死亡更多。

2D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的局限性

二維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)無法模仿體內(nèi)腫瘤的固有特性，包括天然屏障，低氧梯度和減緩藥物擴(kuò)散的緊密細(xì)胞間 連接。 此外，它們?nèi)狈χС?D生長和癌蛋白上調(diào)的組織特異性環(huán)境和ECM（Reynolds，2017）。 再次查看 圖2A，表明3D中的胰腺癌細(xì)胞比2D單層中生長的相同癌細(xì)胞對CIS的抵抗力更高。 在這里很明顯，僅進(jìn) 行2D研究對于體內(nèi)胰腺癌的治療會產(chǎn)生誤導(dǎo)和不準(zhǔn)確的預(yù)測。

圖 2. 順鉑（A）或吉非替尼（B）處理的乳腺癌細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞的劑量反應(yīng)曲線。 使用代謝MTS測定法，相對于未處理的對照，確 定細(xì)胞活力。 數(shù)據(jù)讀取為6次重復(fù)的平均值±SEM。

結(jié)論

*使用CELLINK GelMA和Coll 1作為類瘤的支架，可為球體形成和藥物擴(kuò)散提供穩(wěn)定的TME。

*用GelMA和Coll 1制成的構(gòu)建體的不同殺傷曲線模式表明，ECM在藥物反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。將來需要進(jìn)行研究以確定哪種支架適合特定的腫瘤模型。

*我們的發(fā)現(xiàn)表明，在2D和3D腫瘤模型中，對順鉑和吉非替尼治療的劑量依賴性和細(xì)胞特異性反應(yīng)。在3D模式下，乳腺癌和胰腺癌細(xì)胞系對GEF治療的敏感性要高于2D模式。同樣，乳腺癌細(xì)胞系 在3D中比2D對CIS治療更敏感，但胰腺細(xì)胞系顯示相反的作用，表明3D模型中耐藥性水平升高。

*生物打印的類瘤是用于藥物篩選的相關(guān)3D模型，可用于減少假陰性和假陽性預(yù)測的情況。未來的研究 可以使用BIO X擴(kuò)大類瘤的生產(chǎn)，以進(jìn)行高通量藥物測試。

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