用于新型冠狀病毒病（COVID-19）研究的生物3D打印氣道上皮模型

摘要

基于細(xì)胞的體外預(yù)測(cè)模型可能支持國(guó)際上開發(fā)新疫苗和其他治療肺相關(guān)疾病（如 COVID-19、慢性阻塞性肺病或特發(fā)性肺纖維化）的努力。將3D生物制造與氣液界面培養(yǎng)相結(jié)合，可以對(duì)組織模型進(jìn)行工程改造，從而在體外重現(xiàn)健康和患病狀態(tài)下呼吸道的典型特征。這些模型不僅提供了深入了解病毒與靶位點(diǎn)宿主細(xì)胞相互作用的潛在機(jī)制的機(jī)會(huì)，而且還有助于減少未來(lái)研究中使用的動(dòng)物數(shù) 量，從而支持 3Rs（替換、減少和細(xì)化）原則。在這項(xiàng)研究中，我們描述了 3D?生物制造氣道上皮模型的生成及其生理相關(guān)性的評(píng)估。該模型的特點(diǎn)是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 2(ACE2)?的表達(dá)，ACE2 是冠狀病毒內(nèi)化所需的一種蛋白質(zhì)。 ACE2蛋白定位于頂膜表明上皮細(xì)胞是極化的，粘蛋白5AC蛋白的存在表明該模型可以產(chǎn)生氣道表面液體，這是氣道上皮細(xì)胞的一種生理功能。因此，這些生物工程組織模型可用于開發(fā)不同的療法和疫苗。

介紹

2019年底出現(xiàn)的新型冠狀病毒病（COVID-19）是由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）引起的。 該病毒具有高度傳播性，并使用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 2 (ACE2) 作為主要受體進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。ACE2 是一種細(xì)胞表面蛋白，存在于許多細(xì)胞和組織中，包括肺、心臟、血管、腎臟、肝臟和胃腸道(Hamming, 2004)。 ACE2 在健康肺組織中適度表達(dá)，在慢性阻塞性肺病 (COPD)、特發(fā)性肺纖維化(IPF)、哮喘、糖尿病和高血壓等病理狀況中高度表達(dá) (Saheb Sharif-Askari, 2020)。 眾所周知，SARS-CoV-2 會(huì)感染呼吸道并傳播到整個(gè)人體，導(dǎo)致多器官感染癥狀（de Melo，2021 年）。 因此，由于病毒對(duì)人類健康的嚴(yán)重影響，開發(fā)新的診斷方法、疫苗和抗病毒藥物迫在眉睫。

圖 1.?(A)?使用 CAMotics?的 3D?生物打印模型圖示，俯視圖（左）和側(cè)視圖（右）。 (B)?3D?生物打印肺組織模型轉(zhuǎn)移到 Transwell?插入物。

體外模型對(duì)于了解疾病機(jī)制以及在臨床試驗(yàn)前驗(yàn)證治療方法至關(guān)重要。 盡管目前的 2D 培養(yǎng)模型在篩選病毒復(fù)制、感染和藥物篩選方面很常見，但它們無(wú)法概括組織的復(fù)雜性和生理學(xué)。 然而，像 3D 生物打印技術(shù)這樣的新平臺(tái)可以生成在分子組成、生物力學(xué)和復(fù)雜性方面更類似于原位組織的組織模型（Singh，2020；Seyfoori，2021）。 這些 3D 生物打印模型可以更好地了解類似于人體器官的微環(huán)境中潛在的宿主-病原體相互作用，從而有助于篩選針對(duì)肺部疾病（如COVID-19）的藥物。

在這項(xiàng)研究中，我們專注于生物打印原代人支氣管上皮細(xì)胞或 Calu-3 細(xì)胞以生成氣液界面 (ALI) 模型。Calu-3 是一種分化良好且具有特征的細(xì)胞系，來(lái)源于人支氣管黏膜下腺 (Zhu, 2010)。 人肺的黏膜下腺是氣道表面液體、粘蛋白和其他免疫活性物質(zhì)的主要來(lái)源。

生物打印的肺病模型在 Transwell 插入物中培養(yǎng) 14 天，并對(duì) ACE2 和粘蛋白 5AC (MUC5AC) 蛋白進(jìn)行免疫染色。 使用本應(yīng)用說(shuō)明中介紹的實(shí)驗(yàn)裝置，可以研究宿主-病原體與 SARS-CoV-2 和氣道上皮細(xì)胞的相互作用（Zhu，2010）。

圖 2.?第 7?天 (D7)?和第 14?天 (D14)?肺組織模型在 10?倍放大時(shí)的 H&E?染色。 位于構(gòu)建體頂部的 Calu-3?和 HBE?細(xì)胞的上皮層。 比例尺=100 μm。

材料和模型

細(xì)胞準(zhǔn)備

在肺組織模型中使用了兩種不同的上皮細(xì)胞類型：人支氣管上皮細(xì)胞（HBEpC；C-12640，PromoCell）和 Calu- 3（肺腺癌細(xì)胞衍生的上皮細(xì)胞；HBT-55，ATCC）。人肺成纖維細(xì)胞（HPF；C-12360，PromoCell）用作支持細(xì)胞。 在根據(jù)各自制造商的協(xié)議進(jìn)行生物打印之前，將細(xì)胞解凍并在 2D 中擴(kuò)增。 HBEpC在氣道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基（C-21060，PromoCell）中培養(yǎng)，HPF在補(bǔ)充有生長(zhǎng)培養(yǎng)基2試劑盒（C-23020，PromoCell）的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基2中培養(yǎng)，分別用于第4代和第9代； 而 Calu-3 細(xì)胞在補(bǔ)充有 10% 胎牛血清 (FBS; 10270106, Gibco Thermo Fisher Scientific) 和 1% 青霉素-鏈霉素-新霉素混合物 (PSN; 15640055，Gibco Thermo Fisher Scientific）并用于第 4 段。

肺組織模型的生物打印

肺模型被設(shè)計(jì)成一個(gè)圓盤，底部有一個(gè)實(shí)心層，頂部有一個(gè) 5 層邊緣（圖 1A、1B）。 這樣做是為了促進(jìn)接種后上皮細(xì)胞的包埋。 該磁盤是用 GelMA-Laminin?521?(GelMA-LN521,?CELLINK)?3D 打印的。 接下來(lái)，將 2?x 106?HPF 用胰蛋白酶消化、洗滌、收集、旋轉(zhuǎn)并輕輕重懸于 100?μL 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基 2?中，然后將其小心地混合到1mLGelMA-LN521生物墨水中，預(yù)熱至37°C并轉(zhuǎn)移到琥珀色墨盒中（?CSO010311502，CELLINK）。 為了去除截留的氣泡，將嵌入 HPF?的 GelMA-LN521?濾芯以 460g 離心 1?分鐘。 在開始打印會(huì)話之前，將墨盒安裝在 BIO?X? 生物打印機(jī)中設(shè)置為 27°C 的溫控打印頭（00000020346，CELLINK）中 20 分鐘。 將藥筒倒置 2 至 3 次以避免細(xì)胞沉淀。 GelMA-LN521 生物墨水的合適生物打印溫度為 26°C 至 27°C。然后在 12 孔板中使用溫控打印頭在 27°C 下對(duì)圓盤籃進(jìn)行生物打印。 首先使用 405 nm 光固化模塊（距離設(shè)置為 5 厘米）對(duì)每個(gè)構(gòu)建體光固化 12 個(gè)圓盤復(fù)制品，并將成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基添加到每個(gè)孔中。 然后在添加上皮層之前，將圓片在成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中于 37°C 孵育 3 天。

圖 3. HBE?細(xì)胞中 ACE2?的免疫染色。 在 ALI?培養(yǎng)的構(gòu)建體上不同天的 ACE2（綠色）和細(xì)胞核染色 DAPI（藍(lán)色）。 比例尺=100 μm。

增加肺上皮層

對(duì)于上皮層，將?HBE?或?Calu-3?細(xì)胞分別重懸于氣道上皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基或?MEM?完全培養(yǎng)基中，并補(bǔ) 3充 5 ug/mL LN521。將 150K 細(xì)胞/cm2 接種在每個(gè)圓盤的頂部。從孔中取出成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基，將5 x 105 個(gè)細(xì)胞重新懸浮在 360 μL 的完全培養(yǎng)基中，并在每個(gè)圓盤的頂部添加 30 μL 的細(xì)胞懸浮混合物。接種后將構(gòu)建體留在工作臺(tái)上 10 分鐘，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中再放置 20 分鐘以使細(xì)胞附著在生物打印盤上。將 HBE 構(gòu)建體以 1:9 的比例輕輕浸入成纖維細(xì)胞和氣道上皮培養(yǎng)基的混合物中；將 Calu-3 構(gòu)建體以 1:9 的比例浸入成纖維細(xì)胞和 MEM 培養(yǎng)基的混合物中。浸沒培養(yǎng)物在37°C、5% CO2 下生長(zhǎng) 4 天，然后轉(zhuǎn)移至 ALI 培養(yǎng)物。 ALI 培養(yǎng)是通過將結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到 Transwell 插入物中來(lái)建立的，該插入物補(bǔ)充了適當(dāng)體積的相同介質(zhì)，如上所述（圖 1B）。培養(yǎng)基每 2 至 3 天更新一次。

圖 4.?Calu-3?細(xì)胞中 ACE2?的免疫染色。 細(xì)胞在 ALI?培養(yǎng)物中的 GelMA-LN521?上生長(zhǎng)。 在第 7?天 (D7) 和第 14?天 (D14)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定、切片和 ACE2?染色（綠色）。 使用 DAPI（藍(lán)色）可視化細(xì)胞核。 構(gòu)建體在明場(chǎng)中可視化以查看 ALI。 比例尺 = 100?μm。

分析

根據(jù) CELLINK 的固定方案，在第 7 天和第 14 天（ALI 培養(yǎng)）收集樣本，并在 4% 多聚甲醛 (PFA) 中固定進(jìn)行組織學(xué)染色。 然后將樣品包埋在石蠟中，按照 CELLINK 的切片協(xié)議，使用切片機(jī)獲得10 μm 切片。 按照 CELLINK 的免疫熒光方案并使用 Alexa Fluor 488（A-11029，Thermo Fisher Scientific）作為二抗，對(duì)切片進(jìn)行 ACE2（MAB933，R&D Systems）和 MUC5AC（AB3649，Abcam）染色。 樣品也按照 CELLINK 的方案進(jìn)行了 H&E 染色。 所有協(xié)議都可以在 CELLINK 網(wǎng)站的 Support 選項(xiàng)卡下找到。

圖 5. HBE?細(xì)胞中粘蛋白的免疫染色。 細(xì)胞在 ALI?培養(yǎng)物中的 GelMA-LN521?上生長(zhǎng)。 在第 7?天 (D7)?和第 14?天(D14)，細(xì)胞被固定、切片并染色 MUC5AC（紅色）。 使用 DAPI（藍(lán)色）可視化細(xì)胞核。 構(gòu)建體在明場(chǎng)中可視化以查看ALI。 比例尺 = 100 μm。

結(jié)果與討論

用于生成肺組織模型的制造方法創(chuàng)建了一個(gè)完整且堅(jiān)固的構(gòu)造，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中保持其形狀。 樣品橫截面的H&E 染色顯示，接種在構(gòu)建體頂部的 Calu-3 和 HBE 細(xì)胞在第 7 天形成了緊密的單層。然而，在第 14天，Calu-3 細(xì)胞形成了厚的多層上皮樣 結(jié)構(gòu)，而 HBE 細(xì)胞仍然保持薄的單層（圖 2）。 這表明初級(jí)支氣管上皮細(xì)胞保持了接觸抑制，這種抑制在癌細(xì)胞中丟失，導(dǎo)致細(xì)胞相互重疊生長(zhǎng)。

圖 6.?Calu-3?細(xì)胞中粘蛋白的免疫染色。 細(xì)胞在 ALI?培養(yǎng)物中的 GelMA-LN521?上生長(zhǎng)。 在第 7?天 (D7)?和第 14 天 (D14)，細(xì)胞被固定、切片并染色 MUC5AC（紅色）。 使用 DAPI（藍(lán)色）可視化細(xì)胞核。 構(gòu)建體在明場(chǎng)中可視化以查看 ALI。 比例尺 = 100?μm。

接下來(lái)，我們對(duì) ACE2 進(jìn)行了免疫染色，ACE2 是一種參與冠狀病毒內(nèi)化的細(xì)胞表面蛋白。在 HBE 樣本中，在第 7 天單層中很少有細(xì)胞對(duì) ACE2 進(jìn)行染色，而在第 14 天，在許多細(xì)胞中檢測(cè)到 ACE2 染色（圖 3）。與HBE 不同，Calu-3 樣本中的大多數(shù)細(xì)胞在第 7 天和第 14 天都對(duì) ACE2 進(jìn)行了染色（圖 4）。此外，在頂端膜域（ALI 培養(yǎng)中的空氣表面）觀察到 ACE2 的免疫染色，如在第 14 天樣品中朝向頂部 Calu-3 細(xì)胞的局部綠色信號(hào)所見（圖 4），表明細(xì)胞層是極化的。這些數(shù)據(jù)一起表明，我們的 Transwell 模型顯示了極化的氣道上皮細(xì)胞，在原代細(xì)胞和癌癥衍生細(xì)胞中都表達(dá)了 ACE2。

為了進(jìn)一步表征模型，我們對(duì) ALI 培養(yǎng)結(jié)構(gòu)中的粘蛋白進(jìn)行了免疫染色，因?yàn)閾?jù)報(bào)道 MUC5AC 是由氣管支氣管表面上皮中的杯狀細(xì)胞產(chǎn)生的 (Kesimer, 2009)。我們?cè)?ALI 培養(yǎng)模型中觀察到 MUC5AC 在 HBE 和 Calu- 3 細(xì)胞中的表達(dá)（圖 5、6），表明細(xì)胞已經(jīng)分化。我們的數(shù)據(jù)共同表明，這里介紹的 3D 生物制造模型將為設(shè)計(jì) 3D 肺組織模型提供一個(gè)極好的工具，以快速篩選針對(duì) COVID-19 的生物制劑。這也將有助于減少動(dòng)物研究，從而支持 3R 原則。

結(jié)論

該研究表明，3D 生物打印與 Transwell 細(xì)胞培養(yǎng)相結(jié)合可用于生成復(fù)雜的體外肺上皮模型。

* 體外 ALI 模型顯示 ACE2 和 MUC5AC 蛋白的表達(dá)。

* 原代支氣管上皮細(xì)胞在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中保持緊密的單層，而 Calu-3 細(xì)胞在第 14 天形成多層上皮。

* 與腺癌細(xì)胞來(lái)源的 Calu-3 細(xì)胞系相比，ACE2 在原發(fā)性支氣管上皮細(xì)胞中的表達(dá)中等。

* ALI 培養(yǎng)中生長(zhǎng)的細(xì)胞變得極化，如培養(yǎng)物頂膜上 ACE2 的表達(dá)所見。

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