目前對功能組織的生物打印方法缺乏適當的生物制造技術來構建復雜的三維微結構，這對指導細胞生長和促進組織成熟至關重要1。中樞神經系統（CNS）結構的3D打印尚未完成，可能是由于中樞神經系統結構的復雜性。在這里，我們報道了使用一種微尺度連續投影打印方法（μCPP）來創建一個復雜的中樞神經系統結構，用于脊髓的再生醫學應用。μCPP可以在1.6秒內打印出根據嚙齒動物脊髓尺寸定制的3D仿生水凝膠支架，并可擴展到人類脊髓大小和病變幾何形狀。我們在嚙齒類動物體內測試了裝載神經祖細胞（NPCs）的μCPP 3d打印支架支持軸突再生并在完全脊髓損傷部位形成新的“神經中繼”的能力。我們發現損傷的宿主軸突再生成3D仿生支架，突觸到植入設備的npc上，植入npc進而將軸突延伸出支架和損傷下方的宿主脊髓，以恢復突觸傳遞并顯著改善功能結果。因此，三維仿生支架提供了一種通過精確醫學來促進中樞神經系統再生的手段。在美國，有超過50萬人患有脊髓損傷（SCI），從而造成了巨大的心理和經濟成本。3D打印技術允許制造個性化的支架，“適合”個體損傷的精確解剖，以刺激、引導和對齊軸突再生。普通的噴墨或擠壓生物打印可以創建簡單的結構，如軟骨或血管4，但μ CPP可以使用各種生物材料和細胞創建復雜的三維結構5（圖1a）（圖1b）。噴墨或擠壓打印可以通過液滴或線條之間的人工界面損害機械完整性；μ CPP無層印刷結構不顯示平面偽影（界面）。只需1.6秒就需要打印一個2毫米的支架（補充視頻1），其速率~比傳統的噴嘴打印機快1000×5。使用聚焦光進行聚合，可以產生1 μ m的打印分辨率。我們設計了一種支持損傷后再生的大鼠脊髓支架(圖1a)。直徑200 μ m的微通道與損傷上下寄主軸突束對齊(圖1d,e)。脊髓內部的“灰質”區域通常在損傷部位下方沒有軸突;因此，我們將該區域做實，以增強結構的完整性(圖1d)。支架的彈性模量260 – 300kpa(圖1k)，與正常脊髓(200 – 600kpa)相似6-8。
為了驗證概念，我們打印了符合幾個不同和復雜的人類脊髓病變腔的精確形狀和尺寸的支架，包括挫傷病變（圖1F-J和補充圖·圖）和刀切（補充圖1B圖）。然后我們將支架植入T3完全脊髓橫斷的大鼠體內。11只費舍爾大鼠植入2毫米長的3D仿生支架；11只接受3D仿生支架，由聚乙二醇-甲基丙烯酸明膠（PEGGelMA）制作的；8個對照組只接受病變；8名對照組接受無支架的大鼠NPCs；7只動物接受含有200μm通道（瓊脂糖支架9-14）的瓊脂糖支架，以與3DPEGGelMA打印支架進行比較。4周后，三維仿生支架的通道和實心仍保持植入前結構，無斷裂或變形（圖2a）。由透明質酸等其他材料組成的三維仿生支架，在4周后迅速降解和塌陷（補充圖2）。維持支架結構至少4周被認為是在病變部位保持物理支持和排列病變部位的再生軸突的必要條件。PEG-GelMa支架也具有生物相容性，表現出在模板瓊脂糖支架周圍形成的反應性細胞層和顆粒化組織的顯著衰減（圖2b和補充圖2）。與瓊脂糖支架相比，3D仿生支架周圍的宿主反應細胞層的厚度也減少了35%（P<0.05；圖2b，右）。通過對小膠質細胞和巨噬細胞的IBA1標記顯示，支架植入并沒有加劇脊髓炎癥反應（補充圖3）。重要的是，反應性星形膠質細胞的反應被3D仿生支架修飾：在對照組病變和瓊脂糖支架的接受者中，一層反應性星形膠質細胞“包圍”了病變（圖2c，左）。相比之下，星形膠質細胞突起被3d打印支架重新排列，不再在宿主/支架界面上形成“壁”；相反，星形膠質細胞突起與支架的開放通道顯著地縱向重新排列，沿軸突軸穿透支架通道（圖2c，右，補充圖4）。此外，對宿主/病變/移植物界面總膠質纖維酸性蛋白（GFAP）免疫反應性的定量分析顯示，與其他損傷動物相比，植入3D仿生打印支架的動物數量顯著降低(P < 0.05；圖2c，右）。
甲苯胺藍和RECA-1免疫標記顯示，空支架很容易和廣泛的血管化（圖2d）。標記為神經絲200（NF200）的損傷宿主軸突再生成空的3D仿生支架，很容易通過宿主/支架界面。在支架壁的引導下，穿透支架的軸突沿脊髓吻側-尾軸線性生長（圖2e，右)；這與瓊脂糖支架與宿主10、11界面上頻繁的軸突錯位和偏轉相反(圖2e，左）。在三維仿生支架中，每個通道的神經絲標記再生軸突的平均數量為97 ± 8，距離吻側宿主/支架界面1 mm。宿主的5-羥色胺能軸突也能再生到支架中（圖2f，左），平均有11個±5的5-羥色胺能軸突到達支架的尾端（圖2f，右）。來自外周神經系統的宿主雪旺細胞11遷移到支架中，并將許多再生的宿主軸突包裹或重新髓鞘（圖2g-i）。神經干細胞（NSCs）和NPCs是促進受損宿主軸突再生為SCIS的一種手段 。
圖1 | 3d打印支架模擬脊髓結構。a、3d打印機設置:紫外光源(365 nm波長);一種用于分片圖像流生成和系統同步的計算機用于光學圖案生成的數字微鏡裝置(DMD);一套投影光學裝置;一種用于樣品位置控制的工作臺;以及用于在線監測制作過程的CCD(電荷耦合裝置)成像系統。b、μCPP無層3D打印創建無離散層結構。在基于擠壓的3d打印方法中(左)，隨著舞臺在z軸上移動，材料被擠壓，在水滴之間創建圖層。CPP印刷(右)創造了一個連續層結構。完整T3大鼠脊髓軸突重鏈神經絲(NF200)標記。吻端在圖像的左邊，尾端在圖像的右邊。白質(面板頂部)的軸突高度排列成平行排列，從嘴側到尾側。灰質中的軸突(圖底部)不是線性的。白線是白質和灰質之間的分界線。所插入的原理圖指示了水平截面的方向。d，脊髓中的軸突排列成包含相關功能軸突的區域(束)。運動系統用綠色表示，感覺系統用藍色表示。C，皮質脊髓束;Ru,rubrospinal tract;Ra, raphespinal tract;Ret，網狀脊髓束;Pr，本體脊髓束;ST，多巴丘腦束;DC，背柱感覺軸突。我們的支架模擬了白質的線性組織。通道是在3D空間中精確打印出來的。e，解釋軸突排列和引導假說的示意圖。受損的宿主軸突(如皮質脊髓束(CST)、紅脊或網狀脊髓軸突)再生到支架中，并在通道內與NPC衍生的軸突形成突觸，NPC神經元依次將軸突從損傷部位下方的支架中延伸出來(綠線)，進入病變下方的相同白質束。由線性微通道引導。支架在病變部位保持其三維坐標，與自然宿主結構相匹配。f，人類臨床完全性脊髓損傷(ASIA A)矢狀位頸椎正中t1加權磁共振圖像。病變的前部(右側)可見一小塊空閑的宿主白質(箭頭)。圖像旁邊顯示病變的大小。g，從f繪制囊性病變空洞輪廓。h，需要3D打印的支架計算機輔助設計(CAD) 3D模型，對應于精確的病變形狀。i，打印的支架與f. j中所示的尺寸相匹配，假設適合人體挫傷腔中打印的3D支架。k，利用動態力學分析對支架彈性模量進行力學測量。N =3個支架試樣進行動態力學分析。數據為均值±s.e.m，比例尺為50 μ m(c)。
來自損傷上方的損傷宿主軸突的活性可以通過植入的神經干細胞形成的繼電器跨損傷傳遞到損傷下方的宿主神經元，支持功能改善1,2,15,16。以前，我們在損傷后2周移植 NPC，因為由于有毒血液制品和炎癥17-21，分離的細胞移植物在急性損傷部位存活不佳[1,2,15,16] ; 這些反應在亞急性延遲后減少[18,19,22,23]。支架可以保護移植細胞，當患者進行脊柱減壓和穩定時，提供了在損傷后急性干預的可能性24,25。為了驗證這一假設，我們將支架內的神經干細胞移植到急性 SCI損傷部位，加載表達 GFP 的大鼠 NPC (n = 11只動物; 參見方法)1,2,16。另外一組動物在沒有支架的情況下接受NPC 移植到病變部位(n = 8只動物)。一個月后，NPC 在每個移植動物體內存活并完全填滿了支架通道(圖3a 和補充圖5a)。神經干細胞也存在于支架和宿主脊髓之間的界面，而沒有扭曲支架或宿主脊髓結構(補充圖5a)。共有47 ± 2% 的移植 NPC 表達早期神經元標志物 Hu1(補充圖5b，f) ，20 ± 3% 表達成熟神經元標志物 NeuN (補充圖5c，f) ，21 ± 3% 表達星形膠質細胞標志物 GFAP (補充圖5d-f)和11 ± 2% 表達少突膠質細胞標志物 Olig2(補充圖5e，f)。莖狀態標記巢蛋白沒有檢測到，如預期的移植物分化后。共有2.8% 的植入細胞標記為分裂細胞標記物Ki67。在接受沒有支架的鼻咽癌移植物的動物中，一些細胞存活但總是不能填補病變部位，留下非常大的空隙(補充圖5a)。因此，使用支架將NPC 植入早期病變部位是可行的，但是沒有支架就會失敗，這與之前使用分離或實體細胞移植的報道一致[18-22]。支架似乎提供了一個受保護的環境，可能沒有急性炎癥介質和活性氧物質26。
圖2 | 3d打印空支架植入物4周的體內表現。a，標示為軸突的植入支架橫切面(NF200)。所插入的示意圖表示截面方向。b, nisl染色顯示在瓊脂糖支架(左)或PEGDA-GelMa支架(右)植入部位有反應細胞層(箭頭)。嘴側在左邊，尾側在右邊。黑色虛線劃分了宿主脊髓與支架的界面。盒子和晶須圖顯示了平均反應細胞層(RCL)厚度的定量。方框顯示25 – 75個百分點的范圍，中線是中位數。胡須顯示的四分位數范圍(IQR)是第25或75百分位值的1.5倍。*P < 0.0019(學生t檢驗)，n = 12只動物。c，僅病變動物(無支架)(左)、瓊脂糖支架(中)或3d打印支架(右)的GFAP免疫反應顯示宿主神經膠質“疤痕”。嘴側在左邊，尾側在右邊。在3d打印的支架中，膠質過程縱向地與通道對齊。盒須圖顯示了病變部位周圍宿主脊髓中平均GFAP強度的量化。這些方框顯示了25 – 75個百分點的范圍，中間的標記是中位數。胡須顯示的IQR值是第25或75百分位值的1.5倍。*P < 0.0001(事后Tukey ‘s單尾方差分析)，n = 11只動物。d, RECA-1免疫標記顯示的支架血管化(左)和甲苯胺藍染色(星號表示血管)(右)。e，左，宿主軸突(標記為NF200)不進入瓊脂糖支架。對，宿主軸突進入3d打印的支架。虛線表示病變部位吻側端宿主/支架界面。f，宿主5ht標記的5 -羥色胺能軸突(白色箭頭)再生到空支架(左)并到達通道尾部(右)。白色虛線劃出了海峽的入口口。g，電子顯微鏡顯示通道內的軸突(星號)與相鄰的鞘狀雪旺細胞(SC)相關。h，放大的通道圖，顯示s100標記的雪旺細胞包裹nf200標記的軸突(箭頭)。i，電子顯微鏡下的通道顯示有髓鞘的軸突和雪旺細胞。比例尺:500 μm (a)、200 μ m (b)、100 μ m (c、e)、25 μ m (d，左)、20 μ m (d，右)、50 μ m (f)、1 μ m (g)、5μ m (h)、0.5 μ m (i)。
在加載NPCs的支架中，大量神經纖維標記的軸突再生(圖3b)。再生宿主軸突排列成平行的線性陣列，采用模仿完整脊髓軸突線性排列的模式(圖3b)。調節脊髓運動系統的宿主血清素能軸突也能再生到加載NPCs的3D仿生支架中(圖3D)，并且在加載NPCs的支架中從支架嘴側向支架尾部線性擴展的數量顯著增加:在有引導支架和npc的動物中，每個通道平均有85±21個血清素能軸突到達病變末端并延伸到宿主遠端脊髓，而在空支架中，到達病變末端的軸突少了8倍(平均11±5個軸突)(圖3g)。在無支架植入npc的動物中，5 -羥色胺能軸突的生長方向是隨機的，而不是線性的(補充圖5g)，且未到達病變的尾側(比較所有組，方差分析
P < 0.0322;事后的杜克;圖3g)。因此，3D仿生支架加NPC移植物顯著促進了宿主軸突再生到損傷部位，偶爾也會在損傷部位之外(圖3e)。位于損傷宿主脊髓尾側的5-羥色胺能軸突不是移植物來源，因為支架中的npc沒有5-羥色胺免疫標記(5HT;5 -羥色胺)和5 -羥色胺能軸突沒有共同標記GFP(補充圖5h)。在支架外2mm處，宿主脊髓的白質和灰質中檢測到血清素能軸突(附圖5i)，病變部位3.5 mm處檢測到血清素能軸突，但超出3.5 mm處檢測不到，這表明這些軸突是再生的(沒有保留)。npc衍生的軸突可被GFP標記識別，且在通道內豐富且線性生長(圖3c)。相比之下，植入病變部位的NPC移植物在沒有支架的情況下向隨機方向延伸軸突(補充圖6)。植入NPC的軸突從支架向尾側和嘴側方向大量延伸至宿主脊髓(補充圖5j)。植入4周后，npc填充通道的軸突超微結構分析顯示軸突的口徑和髓鞘形成的狀態，從小的、無髓鞘的軸突(< 1μm直徑)到大的軸突(1 – 3μm，圖3h)，在一些病例中，有少突膠質細胞髓鞘化(圖3i和補充圖7a)。支架內的非對稱突觸形成并包含圓形突觸囊泡，典型的興奮性突觸(圖3j) 27-29。宿主血清素能的軸突再生到通道與npc源神經元的樹突密切相關，通過共同標記MAP2和GFP來識別(圖3f)。
圖3 |加載npc的3d打印支架植入物4周的體內性能。a，通道中充滿了表達gfp的npc。插入的原理圖指示了該圖中所有面板中水平截面的方向。b，通道的吻側入口被宿主軸突穿過(標記為NF200 (NF));宿主軸突與移植物衍生軸突的區別在于不表達GFP。c，植入表達gfp的NSCs在支架內延伸線性軸突。嘴側在左邊，尾側在右邊。d, 5ht標記的宿主血清素能軸突從病變的嘴側(左)進入充滿npc的通道，并在通道中線性再生(箭頭)。e, 5ht標記的宿主軸突退出通道尾側，再生到病變遠端宿主脊髓中(箭頭)。白線是尾管到脊髓尾管出口的分界線。f，再生到支架通道的5HT宿主軸突與植入npc的樹突(MAP2)形成同位接觸(箭頭)(標記為GFP)。g，定量到達支架尾端的5個ht軸突的平均數量(單尾方差分析P <?0.0322，事后Tukey’s)，?n = 10只動物。這些方框顯示了25 – 75個百分點的范圍，中間的標記是中位數。胡須顯示的IQR值是第25或75百分位值的1.5倍。h，在超微結構水平上，通道內存在不同直徑的軸突(星號)，許多軸突是有髓鞘化的(M)。i，超微結構圖像顯示少突膠質細胞(綠色)向髓鞘化軸突發送多個過程(紅色)。j，突觸(箭頭)在通道內的軸突和植入npc的樹突之間形成。突觸與包含圓形囊泡的突觸前扣子是不對稱的。比例尺，200 μ m (a)，?50 μ m (b)，10 μ m (c,f)，?100 μ m (d,e)，500 nm (h)，?0.2 μ m (i)，?200 nm (j)。
圖4 |加載npc的3d打印支架長期體內研究a-e，植入后6個月的解剖學。a，通道結構完整，充滿了表達gfp的npc。插入的原理圖顯示了圖中所有面板中水平截面的方向，吻端在左側。b，皮質脊髓軸突進入支架并沿尾側方向線性延伸。c, CST軸突聚集在通道內一個neun標記的神經元上，與體形成類似bouton的接觸。d, GFP軸突從支架向病變尾部宿主白質和灰質延伸。腹外側白質，病變尾側2毫米。e, npc衍生的gfp標記的軸突在灰質宿主神經元(標記為NeuN)上形成興奮性接觸(VGlut2)，位于病變尾側2mm(白色箭頭)。我是，行為研究。f，完全橫斷后BBB運動評分(重復測量方差分析;** p <?0.0232，?* p < 0.0008;均值±s.e.m, n = 10只動物)。g，種植后6個月電生理學研究示意圖。經顱電刺激應用于大腦的運動皮層，從后肢記錄mep。h，使用3d打印、填充npc的支架的大鼠表現出MEP反應，隨后再次橫切支架上方的脊髓可消除MEP反應。空支架的動物沒有歐洲議會議員。藍色箭頭表示刺激偽影。綠線代表幾個個體刺激的平均值，用黑色表示。i，植入含npc支架的動物MEP平均振幅顯著增大。這些方框顯示了25 – 75個百分點的范圍，中間的標記是中位數。胡須顯示的IQR值是第25或75百分位值的1.5倍。(學生t檢驗;P < 0.0001, n = 10只動物)。比例尺:250 μ m (a)、50 μ m (b)、10 μ m (c)、40 μ m (d)、5 μ m (e)。
甲苯胺藍和超微結構分析顯示植入4周后npc負載支架內血管形成(補充圖7b)。觀察到星形細胞端足與血管、周細胞和緊密連接(補充圖7c,d)接觸。因此，血管被開孔，血腦屏障被恢復30,31。我們進行了長期的功能研究。22只大鼠進行T3完整橫斷，分別植入加載大鼠脊髓NPCs的3D仿生支架(n = 11)和空支架(n = 11)。另一組(n = 11)采用無支架的npc移植至急性病變部位1、2。為了使動物數量可控，我們沒有包括只對損傷進行控制，而且因為空的支架只支持有限的宿主軸突向支架的生長。6個月后的解剖學分析顯示支架保留了其三維結構（圖4A)。支架壁厚比植入前尺寸（補充圖8B)減少49%，反映降解緩慢。值得注意的是，NPC存活并充滿了支架通道。 相比之下，沒有支架的病變移植物不完全成活并填充病變（補充圖8a)，留下大的空洞。 因此，在急性SCI中植入3D打印支架可使干細胞持續存活和部位充盈，盡管急性環境是炎癥和細胞毒26。 在植入空支架的動物中，宿主神經絲標記的軸突再生到支架（補充圖8C)中的數量相對較少(118±8)，與植入4周后觀察到的數量(97±8)相似。
在任何情況下，在植入空支架的動物中，宿主軸突都不會在支架外再生到宿主遠端脊髓中(數據未顯示)。在植入裝有npc的3D仿生支架的動物中，移植細胞存活了6個月，并完全填充了通道(圖4a)。Nestin標記未檢測到，提示植入NPCs成熟，Ki67標記未檢測到，提示細胞分裂完成。在4周支架中觀察到，5ht免疫反應軸突進入支架(補充圖8d)。共87±5個血清素能軸突到達負載npc的通道尾端，并繼續向脊髓尾端再生，與植入4周后觀察到的軸突數量相似(圖3g和補充圖8d);這一觀察結果表明5-羥色胺能軸突向支架的再生在4周內完成。將AAV2-RFP載體順行注射到運動皮層的宿主皮質脊髓運動軸突也再生到負載npc的支架中(圖4b)，并延伸到支架中點，距離為1mm(補充圖8e)。皮質脊髓軸突在支架通道內neun標記的神經元上形成了推定的bouton樣結構(圖4c)，這與之前的報道一致，即宿主皮質脊髓軸突再生到NPC移植物中，形成移植物神經元內vglut1標記的興奮性貼附1。此外，移植物來源的gfp標記的軸突從支架投射到宿主脊髓損傷的尾側(圖4d)，與損傷部位的宿主神經元尾側形成緊密的貼壁，與興奮性突觸標記物VGlut2共定位(圖4e)。支架移植物衍生的軸突生長到遠端宿主脊髓的數量(圖4d)大大超過支架以外宿主血清素能軸突再生的數量(補充圖8d);這一觀察結果表明，如果存在損傷部位恢復的神經傳導，很可能是由宿主軸突再生到支架、與移植物NPCs形成突觸以及NPCs衍生的軸突延伸到遠端宿主脊髓的傳導所介導的。在接受無支架急性鼻鼻炎移植的動物中，標記有神經絲和血清素的宿主軸突也能穿透病變部位的部分移植物填充(補充圖8f,g)，但軸突生長的方向是隨機的，而不是在支架內的移植物中觀察到的線性生長模式(補充圖8f,g)。為了確定3D仿生支架是否支持運動功能恢復，使用Basso,Beattie和Bresnahan (BBB)運動量表32對動物進行了為期5個月的評估。與空支架相比，植入npc支架的動物表現出顯著的功能恢復。缺乏支架的鼻咽癌移植物與植入空支架的動物的表現并無差異，這表明當移植物不能填充病變腔，且從病變嘴側延續到病變尾端時，僅存在干細胞不足以支持功能恢復(圖4f)。在支架中植入NPC的動物的BBB評分中，功能評分的平均值為6.6±0.5分(±s.e.m.)，表明后肢每個關節的運動，而在空支架中為0.3±0.2分，在NPC移植物對照組為1.6±0.8分。僅反映一個關節周圍不一致的運動(*P < 0.0001，重復測量方差分析;個別時間點和事后Tukey的t檢驗;圖4f)。通過測量后肢對腦電刺激的肌源性運動誘發電位(MEPs)，我們進一步研究了整個橫斷部位電生理傳遞的神經傳導的形成(圖4g,h)33,34。3D仿生聚乙二醇雙丙烯酸酯(PEGDA) -GelMa支架植入NPCs后5個月大鼠運動誘發反應恢復(MEP平均振幅270±5μ V;平均潛伏期11.3±0.7 ms)，而植入空支架的動物表現出在基線噪聲范圍內的反應(平均MEP振幅25.1±5.7 μ V, P < 0.0001，學生雙尾t檢驗;平均潛伏期15.3±0.8 ms;P < 0.0001，學生雙側t檢驗;在C8水平(植入位點的吻側)再次切斷脊髓導致后肢所有誘發電位的喪失(圖4h)，證實了新的電生理繼電器在病變部位的形成。‘這項研究展示了使用快速3D打印創建仿生中樞神經系統結構的可行性。這些支架可以很容易地個體化和縮放到任何患者特定的病變形狀和長度。雖然我們和其他人已經注意到引導軸突通過病變部位10-13，35-37的重要性，但在這里我們展示了宿主軸突完全再生超過了由生物工程支架支持的嚴重的、完全的脊髓橫斷部位。此外，大多數脊髓損傷患者在手術減壓時，支架對NPCs的植入起著急性支持作用；因此，3D仿生PEGDA-Gelma支架為神經干細胞移植損傷后早期干預提供了一種潛在的手段。再生宿主和干細胞衍生軸突的生長在穿過支架時呈明顯的線性。雖然以前的研究已經將生物工程支架引入SCI10-13，35-37位點，但大多數報道未能解決宿主對支架的炎癥反應。值得注意的是，我們的pegda-gelma支架重組了損傷部位星形膠質細胞的反應，使宿主星形膠質細胞與宿主軸突束的生長軸一致38，而不是阻止軸突生長39。這可能支持廣泛的宿主軸突再生進入，并在5-羥色胺能宿主軸突的情況下，從病變部位進入遠端宿主脊髓。
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