區別3D生物打印與其他3D細胞培養技術的一個關鍵特征是其對創建結構的精確控制。這種特性?允許高分辨率制造具有可控結構和機械性能(如孔隙度、滲透性和剛度)的仿生結構。然而，分析打印??后的細胞動力學并優化其在3D制造環境中的功能只能通過反復試驗和復制幾個實驗來實現。這個問題?促使了細胞自動機模型的首次開發，以模擬3D生物打印結構中的打印后細胞行為。為了改進我們的模?型，我們使用MDA–MB–231細胞負載水凝膠生物打印了一個3D結構，并在11天內評估了細胞功能，包 括活力和增殖。結果表明，我們的模型成功地模擬了生物3D打印結構，并捕獲了體外觀察結果。我們?證明了該硅模型可以預測和闡明不同初始細胞數量的生物鏈接和不同的生物鏈接配方的明膠和海藻酸?鹽打印后的生物學功能，而無需重復幾個昂貴和耗時的體外測量。我們相信這樣的計算框架將極大地?影響3D生物打印的未來應用。我們希望這項研究能夠激勵研究人員進一步認識到如何利用硅模型來推?進體外3D生物打印研究。
三維（3D）生物打印是新興的3D生物制造方法之一，它被廣泛應用于再生醫學和組織工程中， 以制造復雜的模擬組織結構1。該技術在個性化治療中具有巨大的應用潛力，更側重于控制藥物釋放、癌癥治療藥物篩選、研究可能的副作用以及分析腫瘤細胞的轉移和侵襲2?。3D生物打印技術將細胞、生?物材料和受控運動系統結合起來，開發復雜的3D結構，并對結構的力學性能、孔隙度、滲透性和剛度?等特征進行精確控制3?–5。該技術通過結合細胞棲息地的重要方面，可以克服傳統3D方法的多個限制。這些方面包括類似于腫瘤的天然細胞外基質(ECM)的非均勻3D微環境，細胞與鄰近細胞和局部ECM?的?復雜相互作用，以及營養物質和氧氣的復雜擴散過程6– 8。因此，這種方法可以更好地代表細胞生長機??制的見解，并提供體內腫瘤動力學和癌細胞對治療反應的更緊密預測7。盡管3D生物打印技術發展迅速，但仍有一些挑戰需要解決。目前，生物打印技術主要是在試錯?的基礎上實現預期的輸出，增加了對實驗技術的需求。這種反復試驗的基礎包括優化生物墨水的性能?及其印刷性、結構機械強度和打印期間和打印后的細胞活力9。因此，優化生物打印相關的實驗是非常?昂貴的。這些挑戰使得實驗設計和數據收集在這個過程中變得更加復雜。
圖1所示。本研究涉及的主要步驟示意圖；步驟1：制備由明膠、海藻酸鹽和MDA-MB-231細胞系組成 的生物鏈；步驟2：打印和交聯承載細胞的3D結構；步驟3：進行印后體外檢測；步驟4：開發和校準?一個硅模型。
硅內方法可用于補充體外實驗并協助解決該3D方法的一些局限性10–12。常見的內部方法包括機器 學習(ML)方法和機制建模。機器學習模型可以進一步分類為深度神經網絡、隨機森林、支持向量機(SVM)和樹分類器。機器學習越來越多地應用于3D打印過程的不同階段，如工藝優化、施工精度分析?、缺陷診斷和生物墨水性能預測13。例如，Xu等人14成功地使用ML方法創建了一個預測模型，以良好 ?的靈敏度預測細胞活力，并評估各種工藝參數(包括紫外線強度和紫外線曝光時間)對基于立體光刻的??3D生物打印中細胞活力的重要性。多項研究也試圖開發不同的基于ml的技術來優化生物墨水的可打印 性。例如，Lee等人15使用多元回歸分析證明了印刷適性與油墨機械特性之間的關系。然而，盡管ML模?型在生物醫學領域的應用取得了很大的進展，但由于數據收集的過程和研究的目的，這種方法面臨著?一些局限性。
為了做出準確的預測，機器學習模型需要大量的數據，選擇合適的算法，并確定感興趣的輸入和輸出16。從生物打印研究中獲取大量數據可能是不切實際的，這些研究涉及昂貴的細胞和材料以及???耗時的過程。ML應用程序的另一個常見挑戰是它們可能難以解釋。這可能會導致尋求生物打印結構中 細胞行為機制解釋的研究人員缺乏信任17。相比之下，機制建模關注的是通過對潛在機制的假設來描???述現象。機制模型包括隨機和基于主體的模型、離散模型、常微分方程(ode)和偏微分方程(PDEs)。這?種機制模型可以提供洞察生物打印結構中細胞行為的機制方面。因此，它們是我們在這項研究中首選??的數學技術。
作為生物3D打印過程的一部分，對機械建模和仿真的研究越來越多。例如，有多項數學研究預??測了施加在噴嘴中的生物鏈接和細胞上的剪切應力18,19 ；基于生物墨水材料性能的最終打印結構力學性?能預測20；并模擬生物鏈接的沉積過程和3D結構的最終形狀9。這些數學技術試圖模擬生物打印過程-在?生物打印過程中和之后-研究不同參數對生物打印的各個方面的影響，包括細胞活力和結構穩定性。
然而，關于細胞嵌入生物3D打印結構的打印后行為的全面計算研究尚未報道。這樣的數學研究?可以為研究人員提供更多關于打印后細胞功能的見解，并允許他們預測復雜的細胞活動和優化細胞微?環境，通過將實驗評估保持在最低限度來節省金錢和時間。這是第一項旨在開發體外和硅生物3D打印?乳腺癌模型的整合研究，以研究嵌入生物3D打印結構中的乳腺癌細胞群的打印后行為（圖1）。在體??外研究中，我們使用了MDA-MB-231細胞系，這是癌癥相關研究中最常用的最具侵襲性的乳腺癌細胞?系之一。為了開發生物墨水，選擇明膠和海藻酸鹽的混合物作為3D生物打印中最常見的生物墨水材料,因為它具有與天然ECM相似的特性，并且具有適合生物打印應用的生理和生物學特性21。在我們的??計算機研究中，我們選擇了元胞自動機建模，其中大部分參數都是從實驗數據中選擇的。為了提高模?型的可靠性，還進行了全面的體外實驗。
本研究中提出的基于主體的模型有利于展示復雜的細胞系統，包括細胞增殖、運動、細胞與環?境的相互作用（例如，ECM、鄰近細胞和資源消耗）以及支架內的細胞聚集。在這項研究中，我們證??明了數學模型和計算機模擬可以用來捕捉體外動力學。這種體外和芯片研究的結合可以提高研究人員?對3D生物打印結構中細胞活動的理解，從而加速和提高優化和實驗設置的準確性。所提出的硅模型是?非常有前途的，并能夠進一步發展，應用于3D細胞培養使用生物打印技術在不同的生物醫學應用。
結果與討論
體外細胞研究。成功打印出腫瘤樣水凝膠網絡模型（圖2a）。為了確定包埋在水凝膠中的MDA-MB-??231細胞的增殖情況，采用MTT法監測細胞在第0、4、7、10和11天的代謝活動。如圖2b所示，與第0天?相比，3D細胞/水凝膠構建的MDA-MB-231細胞在第4、7、10和11天分別表現出1.86倍、2.7倍、2.78倍?和2.8倍的增殖。確實，細胞在前7天表現出快速增殖，從第7天到第11天幾乎保持了幾乎穩定的細胞??增殖。有趣的是，結果表明，在3D微環境中封裝的MDA-MB-231的倍增時間比在2D培養中生長的細胞高?3倍，這可以歸因于3D基質中細胞活性的降低22。從第7天到第11天，增殖細胞的數量大致保持不變，留下了一個問題:細胞是死亡還是由于不希望的條件進入非增殖期（靜止期）。為了回答這個問題，?在11天的時間里，我們進一步采用了活死實驗和Ki-67免疫染色，以更好地了解包裹在3D支架中的細?胞行為生長采用活死染色法觀察MDA-MB-231?在11天內的生存能力，結果與?MTT試驗結果。如圖2所示，打印?后大部分細胞都能存活，第0天細胞存活率為76±2%，這清楚地表明生物打印過程對細胞活力的損害??較小。第1周存活率逐漸提高，第4天和第7天分別達到98±1%和99±1%。因此，該結構具有足夠的多??孔性，使氧氣和葡萄糖能夠通過水凝膠支架擴散和分布，為細胞提供適宜的生存環境。從第7天到第1?1天，雖然有部分細胞死亡，但大部分細胞存活，第11天存活率達到96±2%。通過對比活死實驗和MTT?實驗的結果，可以得出結論，在支架達到最大容量的7天后，有相當一部分細胞進入了靜息期，部分??細胞在長期靜息期開始死亡，或者是由于缺乏資源。本實驗中的細胞死亡幾乎可以忽略不計，這說明?明膠/海藻酸鹽支架在生物打印中的應用前景廣闊。
為了觀察MDA-MB-231的增殖能力，將細胞固定，并使用抗Ki-67抗體在共聚焦顯微鏡下對增殖細?胞進行成像（圖3，4）。Ki-67是一種常用的標記物，在細胞周期的所有活躍階段都存在，但在細胞??的固定階段則不存在23。結果表明，在第0天和第4天，ki-67的陽性細胞分別接近98±1%和95±2%，而?在第7天，這一數字下降到86±2%，然后在第11天急劇下降到約48.2±2.4。這一結果與前面的數據一?致（圖3），說明在7天內，細胞不僅存活，而且保持了增殖能力。從第7天到第11天，盡管有很大比??例的細胞存活，但由于缺乏足夠的細胞增殖空間，它們處于靜止狀態，無法再增殖。此外，在第7天??和第11天，細胞變得更加聚集，特別是靠近毛孔，細胞聚集中心的細胞由于被其他細胞包圍而顯示出?不增殖。因此，由于沒有足夠的空間放置子細胞，并且由于聚集體中心缺乏營養和氧氣，增殖過程被?中止。
將體外實驗結果用于參數化所建立的數學模型。
圖2?。(A)：利用生物3D打印技術制備細胞/水凝膠結構；(B)：從第0天到第11天，MDA-MB-231在水?凝膠網絡中包埋的增殖。誤差條表示±SD, n≥3。
圖3?。從第0天到第11天，使用熒光活/死檢測試劑盒，顯微鏡圖像顯示了3D水凝膠構建中的MDA-MB- 231細胞的活力。分別用calcein-AM?和 PI?對活細胞和死細胞進行染色（綠色為活細胞；紅色代表死細 胞）。使用激光掃描共聚焦顯微鏡對細胞進行成像。比例尺，50?μm(放大圖像，比例尺，30?μm)。
硅細胞研究。使3D生物打印技術優于其他3D細胞培養技術的一個基本特性是它提供了對創建結構的精確控制。這種特性為制造具有可控結構和機械性能（如孔隙度、滲透性和剛度）的仿生結構提?供了機會24-26。然而，分析打印后支架內的細胞行為僅取決于執行不同的體外測量。實驗測量生物3D打?印結構中細胞行為的某些方面是具有挑戰性的，因為缺乏精確的定量技術，例如定義細胞-細胞和細??胞-微環境相互作用。這個問題促使我們開發了一個數學框架來模擬打印后支架內的細胞行為。這個??框架不僅要克服這些挑戰，而且要在不重復實驗的情況下準確地設計和預測打印后的細胞功能。
使用元胞自動機的基于個體的建模是在細胞水平上模擬細胞生長的時空機制的一種方法27,28。這?種方法是一個動態系統，包括細胞網格，每個細胞都有一組離散狀態29。近年來，CA模型被廣泛用于 ?研究基于各種靜態自動機規則的不同癌細胞機制30。然而，到目前為止，還沒有研究將CA建模應用于 ?使用3D生物打印技術3D培養癌細胞。我們選擇這種數學方法來模擬封裝在3D生物打印結構中的細胞生?長，因為它能夠捕捉3D打印結構的空間特性，并且能夠靈活地探索不同的假設。此外，由于從體外實?驗中獲得的數據包含離散形式的細胞，因此這種離散數學技術將更準確地模擬這一過程。本研究中開?發的框架代表了細胞增殖、活力、運動和與環境相互作用的規則，包括水凝膠和鄰近細胞，以及水凝?膠網絡內的簇形成。本文中演示的計算機結果基于n=100次模擬運行的平均值和標準偏差，其中n是由?一致性分析驅動的（補充材料，一致性分析）。
圖5顯示了在體外和在硅材料中支架內11天的細胞增殖模式，說明它們彼此一致。在細胞增殖??過程中，初始細胞密度和支架容量是我們分別指定為初始變量和C變量的兩個關鍵參數。這些參數的??相應值通過校準來確定，以產生與體外研究的最佳擬合。請注意，所開發模型中的初始細胞密度代表?了薄層內可以相互作用的細胞的有效初始種群，而不是支架中細胞的總數。因此，與實驗設置中的細?胞密度相比，模擬細胞密度減少了一個比例因子。結果表明，模擬細胞和實驗細胞均在7天后達到最??大細胞密度。細胞在支架中達到最大密度所需的時間在很大程度上取決于初始細胞的數量和打印支架?的容量。初始細胞數量越多，支架容量越小，細胞越早達到最大細胞密度，越早停止增殖。因此，通?過微調這些參數并在不同情況下進行模擬，研究人員可以設計實驗以獲得所需的結果，而無需重復體?外分析。
模擬數據也能夠一致地復制活力和增殖實驗結果。如前一節所述，雖然細胞在打印后7天內的存?活率約為99%，但在第7天至第11天，死亡細胞的數量略有增加，此時大部分細胞處于靜止期。因此，
圖4?。生物3D打印構建體中包裹的MDA-MB-231細胞的Ki-67染色。用Alexa?Fluor?546和Hoechst?33?，?342標記的抗ki-67抗體對細胞進行染色（紅色表示ki-67陽性細胞;藍色表示所有單元格）。使用激光?掃描共聚焦顯微鏡對細胞進行成像。比例尺，50?μm（放大圖像，比例尺，30?μm）
為了精確地模擬體外條件，我們假設細胞保持在一個延長的固定期超過指定的小時，由一個隨機數字?（Cd）定義，開始以指定的概率（Pd）死亡。這種觀察結果可以從生物學上解釋為細胞在進入細胞靜 止期后無法重新進入細胞周期。
圖5顯示了在水凝膠網絡中生長的硅MDA-MB-231細胞的快照；以及細胞三維結構的體外顯微圖?像。在這張圖中，你可以看到細胞分布和細胞團形成的進展在0?，4?，7和11天的體外和在硅。在計算機?圖像中，黃色、紅色和黑色細胞分別代表增殖、非增殖和死亡細胞。
第0天，少量細胞分布在水凝膠網絡內。隨著時間的推移，細胞增殖，產生了最初的兩個細胞群?,?然后是更大的細胞群。與體外觀察相似，到第11天，存活率保持在100%左右，第11天存活率略有下??降，為93.74±0.5%0。此外，模擬細胞增殖隨著時間的推移而下降，并且在7天后由于達到支架的最大?容量而顯著下降;最終在第11天降至54.14%±0.25%。11天水凝膠支架內細胞生長的動畫也可在補充材??料中獲得(圖S3)。
除了細胞活力和增殖外，另一個重要因素是細胞在周圍基質中移動的能力。這種模擬也可以應??用于分析細胞運動以及水凝膠網絡中形成的腫瘤簇的結構和分布，而無需實驗評估。腫瘤簇可能是由?于鄰近細胞之間或親本和子細胞之間的相互作用而產生的，這取決于它們的位置和微環境31。事實上，?細胞通過細胞間的物理和信號相互作用進行協調，并形成集群。
在圖S1(補充材料)中，細胞表現出向支架孔爬行的趨勢，然后在這些孔周圍形成簇，因為必需??資源在那里更集中，特別是在7天后。這一事實表明，水凝膠網絡具有有限的資源運輸能力。因此，我?們定義了細胞-細胞信號(LC)和細胞-孔吸引（Lp）的特定吸引力范圍，以考慮不同的細胞遷移方向。
運動速度是影響星團形成的另一個重要參數。Fallica等研究表明，由于材料剛性和細胞受體的錨定作?用，癌細胞在三維微環境中運動受到抑制，且運動速度極低22。因此，基于本研究和以往研究的觀察，?我們對細胞運動速度進行了校準。在運動過程中，每個個體在特定時間(定義為mC)沿著基于細胞吸引??力確定的方向運動。在校準過程中，通過比較體外和計算機上的結果，得出的結論是，與支架表面/孔?隙(Lp)相比，在較小的吸引力范圍(LC)內，細胞向鄰近細胞移動的傾向較小。在模型中應用這些規則??(圖6)，細胞在運動和簇形成方面模仿體外細胞行為。該模型的結果與先前的研究一致22,32。
總的來說，該模型是為了結合體外3D生物打印評估而開發的，從而對整個3D制造結構進行全面?分析。該模擬的主要應用之一是預測在未實踐的微環境中打印后的細胞行為，從而提高其復制所需生?物設置的能力。例如，該模型提供了評估不同重要參數(如各種初始細胞密度)在長期內對細胞行為的?影響的機會。這有利于研究人員在不需要重復實驗的情況下產生更適合細胞生長的微環境。例如，他?們可以從大小或結構形狀方面設計支架，?目的是修改支架的容量，以提高細胞增殖和減少細胞死亡。
硅學模型驗證。為了進一步驗證硅模型，我們在兩種不同的情況下使用不同的實驗變量進行生物打印過程：情況1：不同的初始細胞密度；案例2：不同的生物油墨配方。在案例1中，我們使用含有4%?(w/?v)明膠、4%?(w/v)海藻酸鹽和1.5×1 06 MDA-MB-231細胞mL – 1的生物墨水進行生物打印。案例2：我?們使用終濃度為4%?(w/v)明膠、5%?(w/v)海藻酸鹽和2×1 06 MDA-MB-231細胞mL – 1的生物墨水進行??生物打印實驗。使用校準的計算機模型，我們想預測細胞在這兩種新條件下的增殖模式。
圖7顯示了病例1在體外和在計算機上10天的細胞增殖模式，說明它們彼此一致。在硅模型中，除?Cinitial(初始細胞密度)外，所有參數與校準模型中的值相同。與實驗設置中的細胞密度相比，模擬
圖6?。中間的面板顯示了MDA-MB-321在硅三維水凝膠結構中的生長情況;黃色代表增殖細胞;紅色代表?非增殖細胞;黑色代表死細胞。左右兩張圖分別為第0天、第4天、第7天和第11天在相差顯微鏡下觀察?到的包裹在3D水凝膠結構中的MDA-MB-231細胞:比尺，50?μm。
細胞密度減少了相同的比例因子，并設置為?Cinitial = 2000。模擬和實驗均表明，7天后細胞密度 ?未達到最大，仍在繼續生長。因此，當初始細胞數量減少時，后期細胞達到其支架能力并因此停止增?殖。
圖8比較了病例2的體外和硅細胞增殖模式，也顯示了一致性。在這個實驗中，我們改變了生物?鏈接的配方。增加海藻酸鹽濃度可以增加水凝膠結構的剛性，如前所述 33。還發現微環境的剛度也
會影響支架內細胞的運動和球體的形成34。雖然與剛度直接相關的參數尚未整合到我們的模型中?,?但我們可以通過改變細胞運動的一些規則來調節細胞行為并研究生物鏈接配方和剛度對增殖和遷移?的影響。在含有4%?(w/v)明膠和4%?(w/v)海藻酸鹽的生物墨水校準模型中，細胞每15小時移動一次，?用mc表示。因此，當含有4%?(w/v)明膠和5%?(w/v)海藻酸鹽的生物墨水時，我們降低了細胞在更硬的?微環境中的移動速度，將mc改為20小時，同時保持其他參數不變。將計算機模型的結果與體外數據進?行比較，我們得出結論，對于4%?(w/v)明膠和5%?(w/v)海藻酸鹽基生物鏈，mc=20 h與體外11天內的??增殖趨勢非常接近。
體外觀察顯示，第11天，細胞增殖略有下降，這可能與微環境的剛性有關。事實上，這種剛性?可能會減少細胞的運動和增殖;并阻礙營養物質的運輸，導致細胞隨著時間的推移死亡。對于生物墨??水配方更顯著的變化，有必要將微環境剛度或生物墨水相關參數納入模型，以準確預測細胞行為。然?而，加入4%?(w/v)明膠，5%?(w/v)海藻酸鹽，并對生物墨水配方進行少量修改，我們開發的模型可以?成功使用。
綜上所述，我們可以通過在體外數據中創建變化來驗證我們的模型，并成功地模擬了不同的情?況。因此，我們可以自信地說，這個模型可以幫助研究人員通過預測結果更準確地計劃實驗。事實上?,?研究人員在各種情況下進行模擬并微調相關參數，可以設計實驗以達到所需的結果，而無需重復體外程序。
前景。本研究開發的數學框架可以通過擴展其規則和提高其提供生物系統準確預測的能力，廣?泛應用于組織工程、腫瘤學和制藥行業等不同應用的不同生物打印相關研究。我們的模型可以通過納?入生物墨水相關參數(如剛度和結構完整性)來擴展，這些參數調節細胞行為，包括增殖和遷移以及氧?氣/營養物質向3D網絡的擴散35-39。
此外，所提出的模型可以與機器學習算法集成，并為研究人員提供了預測水凝膠網絡對生物系?統中任何期望目標的時間或結構效應的機會。此外，我們可以使用CA模擬對ML算法進行預訓練，然后?使用遷移學習方法對實驗數據進行訓練。
該模型的另一個應用前景是在多細胞系的異質環境中研究細胞-細胞相互作用和細胞- ecm相互?作用。此外，通過調整規則，該模型可以與藥代動力學建模技術相結合，利用生物3D打印技術模擬3D?細胞培養過程中的藥物治療反應，以幫助研究腫瘤的發展和轉移、藥物篩選等癌癥研究。最后，我們相信這項工作或其與其他建模技術的結合可以顯著影響未來3D生物打印的發展，并?在很大程度上避免進行昂貴和耗時的實驗
結論
到目前為止，在3D生物打印水凝膠中生長的細胞的最佳打印后行為僅通過復制幾個實驗實現，這些實?驗既耗時又昂貴。為了克服這一挑戰，我們開發了一個CA模型來模擬3D生物打印結構中的打印后細胞?動力學。為此，我們首先成功地打印了MDA-MB-231/明膠/海藻酸鹽生物鏈接，并在11天內使用MTT,
Live-dead和Ki-67細胞增殖試驗評估了細胞行為。利用體外實驗結果，我們在CA模型中定義了3D水凝?膠網絡中細胞增殖、活力、運動和簇形成的規則，并校準了模型參數，如加倍時間、運動速度和11天?內死亡概率。我們的模型可以定量捕捉3D支架中細胞在體外打印后的行為，并能夠預測和闡明不同生?物打印條件下的細胞行為。例如，它復制了細胞運動和細胞向毛孔爬行的過程，然后在7天后由于營??養和氧氣分布不均勻而形成集群。此外，計算機數據闡明了細胞增殖依賴于細胞的初始數量和打印的?水凝膠網絡的容量，并可以根據生物墨水中細胞的初始數量預測打印后的細胞增殖。這種硅模型也可?以用含有明膠和海藻酸鹽的各種網絡配方來表示細胞活性。提出的數學框架可以幫助研究人員產生更?適合細胞生長的微環境，而無需重復實驗。因此，我們的數學框架可以被認為是涉及生物打印相關研?究進步的一個足智多慮的步驟。
材料與方法
材料。從加拿大Sigma-Aldrich公司獲得了褐藻酸鈉鹽、二甲亞砜?(DMSO)、氯化鈉、氯化鈣(CaCl2)?和牛皮明膠(B型)。對于細胞培養研究，MDA-MB-231購自ATCC, DMEM?(Dulbecco ‘s Modified Eagle?Medium)、FBS(胎牛血清)、青霉素/鏈霉素、胰蛋白酶/EDTA溶液0.25%?(w /v)和磷酸緩沖鹽水(PBS)?片購自Wisent Bioproducts?。?(3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基- 2h -溴化四氮唑)MTT粉末、Triton X-100、牛血清白蛋白和多聚甲醛購自加拿大Sigma-Aldrich公司。此外，活/死細胞活力測定?試劑盒(CBA415)， Hoechst 33342nucleus Dye?由Sigma-Aldrich(加拿大)提供。此外，抗ki67抗體(ab15580)和Alexa Fluor 546?山羊抗兔IgG?(H+L)分別購自Abcam和Invitrogen(加拿大)。
細胞培養。MDA-MB-231細胞在T-75瓶中加入10%胎牛血清和1% 100 Uml-1青霉素/鏈霉素的 DMEM中培養。細胞在5% CO2和37℃條件下孵育，每隔一天更換一次培養基。當細胞達到?80%的合流度時，用?DPBS沖洗細胞兩次，然后用胰蛋白酶/EDTA?(0.25%-1X)懸浮。
生物打印。為了制備生物墨水，根據歐陽等人38提供的方案，首先用去離子水制備0.5% NaCl溶液。然后加入明膠和褐藻酸鈉鹽粉，劇烈攪拌?1 h。將配制好的溶液在70℃(30 min, 3次)加熱滅菌，?4℃保存后使用。在生物打印之前，使用混合注射器將?MDA-MB-231懸浮液與制備好的明膠/海藻酸鹽溶?液輕輕均勻混合，制成最終濃度為4%?(w/v)?明膠，4%?(w/v)海藻酸鹽和2-2.5×1 06 MDA-MB-231?細胞?mL-1的生物墨水。
使用CELLINK INCREDIBLE+?擠壓生物打印機進行生物打印。將制備好的生物墨水用針擠壓制成三?維細胞-水凝膠層狀網格結構。具體來說，本實驗使用的打印噴嘴為標準錐形噴嘴 (22G)，針的移動速?度調節為5mm-1。印刷是在室溫下施加適當的壓力完成的。采用?Solidwork軟件進行結構設計，在sli3r軟件中切割成10層，尺寸為10?× 10?× 3mm3?，采用直線填充模式。在打印過程中，我們努力??將壓力保持在最低水平，以使對細胞活力的損害最小。隨后，將攜帶細胞的構建體浸泡在 3% （w/v）?無菌氯化鈣溶液中（20分鐘），使海藻酸鈉與鈣離子交聯21。然后，PBS洗滌三次后，每個結構在含有?10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養基中培養于12孔板中，在5% CO2和37℃下孵育一段預定時?間。每隔一天更換一次培養基。
MTT試驗。采用MTT法檢測三維網絡內細胞增殖。預定孵育天數后，去除含有?3D結構的12孔板中每孔中的培養基，在每孔中加入900μL新鮮培養基和100μL MTT溶液（0.5 mgmL – 1 in PBS?），在37℃CO2培養箱中孵育4 h。控制組是一個沒有任何細胞的3D結構。然后，抽吸培養基后，在每孔中加入?1mlDMSO，在37℃的CO2培養箱中溶解形成的甲醛晶體30min。最后，利用Absorbance Microplate Reader?在540 nm處記錄溶解后的甲醛晶體的強度。
活死檢測。根據制造商的說明，使用活/死染色活力試劑盒在特定時間點對生物?3D打印的細胞負載構建體進行染色，以確定細胞活力。簡單地說，每個構建體在?PBS中洗滌三次。然后，將1μM Calcein-??AM和2μM碘化丙啶加入染色細胞，并在黑暗中孵育。使用激光掃描共聚焦顯微鏡 (蔡司LSM 700)對三維?結構內的活細胞和死細胞進行多點成像。然后使用?ImageJ軟件對圖像進行分析。細胞活力通過將綠色?（活）細胞的數量除以每張圖像中的細胞總數來計算。
細胞增殖。Ki-67細胞增殖試驗是一種評價體外細胞增殖的定量技術。使用這種方法，Ki-67蛋白被用?作細胞增殖的標記物，因為它在活躍的細胞周期(G1, S, G2和M)表達，而不是在固定期(G0)表達。為了完成這篇文章，首先，在預定的時間步長將每個孔的培養基完全去除，并用PBS洗滌每個支架兩次。然后，將支架在4%多聚甲醛的PBS中室溫孵育1小時，使細胞固定。固定結構在含有0.1-0.25%Triton X-100的PBS中滲透15分鐘，用PBS洗滌2次。之后，用3% BSA/0.1% Triton X-100在PBS中阻斷?細胞1小時，然后在PBS/1% BSA中加入濃度為5μgmL-1的Anti-Ki67抗體，在4℃孵育過夜。然后，在加?入山羊抗兔IgG?(H+L)二抗之前，用PBS/1% BSA清洗3次，5分鐘，孵育2小時。然后，在加入Hoechst??33,342(孵育1小時)之前，用PBS/BSA重新清洗2次，5分鐘。最后，使用激光掃描共聚焦顯微鏡對細胞?進行成像。
計算方法
細胞自動機模型描述。該模型將時間模擬為離散的、均勻的時間步長;每個時間步長為1 h，每次模?擬11天。該模型模擬了采用生物3D打印方法制備的多孔細胞負載支架的子域，該子域由190?× 190×30晶格點的方形晶格組成，對稱地由4個寬度為50?× 50?×30晶格點的孔隙組成。水凝膠內的每個?晶格點可以被細胞占用或保持空缺，而孔隙中的網格點應該保持未被占用，因為相應的體外實驗中的?細胞不會移動到孔隙中(Supplementary Material，圖S2)。通過在水凝膠晶格上的隨機位置放置指定?初始數量的細胞來實例化模擬。在每個時間步，細胞的行為都遵循一組描述細胞過程的隨機規則，如?增殖、運動和死亡。生物打印中每個時間步內的主要算法和進程安排如圖9所示。計算框架建立在先??前的理論細胞群工作之上40,41。使用概述、設計概念和細節(ODD)協議制定的詳細模型描述，在補充材?料(補充材料，硅片研究)中提供。
細胞增殖過程。這個過程是模擬每個細胞單獨考慮細胞之間的變化。單個細胞的特征是一個特定的，?隨機的倍增時間，這歸因于每個細胞完成一個細胞周期分裂所需的時間。根據我們的實驗數據，每個細胞的倍增時間從正態分布中選取，其值為μ=96 h，標準差為?σ=6 h。模擬的細胞增殖周期過程包括增殖期和非增殖期(G0)之間的過渡。分裂后，親本細胞保持在當前位置，子細胞可以放置在親本細胞?附近的一個未占用的晶格點上。如果每個相鄰的位點都已被占用，親本細胞進入g0期，即靜止或靜止?期，此時細胞變得不活躍42?。一階、二階和三階摩爾鄰域用于放置子細胞。支架具有指定的最大承載??能力C來容納細胞，當達到該容量的細胞總數時，增殖以指定的概率(P0)終止。承載能力取決于體外??系統的空間和營養限制。C和P0的值根據體外觀察進行校準。由于支架內營養物質和氧氣分布不均，一些細胞在達到支架承載能力后仍能增殖，而另一些細胞則進入G0期。這意味著細胞可以在有足夠的?營養和自由鄰近晶格點的地方繼續增殖。表S1包含了所有芯片參數的值。
運動的過程。在運動過程中，細胞每移動一個特定的時間，稱為?mc，但由于所有細胞的運動可能不同?步，因此引入一個隨機數添加到mc中。mc參數的值也使用體外數據校準。在這個過程中，單個細胞可?以以隨機概率的隨機方式移動，或者以偏倚概率的偏倚隨機方式移動，如果在它們的鄰居中有一個自由的晶格點，它們就會改變它們的位置34。細胞可以以相同的概率向鄰近的六個方向?(右、左、上、下、前、后)中的一個方向移動，這被稱為隨機運動，或者以加權概率的偏隨機方式移動，其中細胞被??其他細胞和附近的毛孔吸引，這是由體外實驗的經驗觀察所激發的。在偏隨機運動中，我們計算每個?方向(direction-p)的運動概率，這取決于一個細胞在其吸引范圍內該方向的鄰近細胞的數量，定義??為(Lc)。此外，每個方向的概率可以根據個體與特定吸引力范圍內的孔隙之間的歐幾里得距離 (Lp)而?增加。在隨機移動情況下，Pup = Pdown = Pleft = right = Pforward = Pbackward = 1/6?，其中6??為方向數，Pup、Pdown、Pleft – right?、Pforward、Pbackward分別為細胞向上、向下、向左、向右?移動的概率。在隨機偏置情況下，Pup = P1, Pdown = P2, right = P3, Pleft = P4, Pforward =P5, Pbackward = P6?，其中 ?6 i=1Pi =1。概率Pi是通過掃描和求和相鄰的細胞和孔晶格點來計算?的。在補充材料中描述了更多細節。最后，每個單元格以更大的趨勢向計算出更高概率的方向移動。
圖9?。體外和硅生物打印的主要步驟。
死亡。在模擬中，我們假設3D生物打印支架的多孔結構允許所有細胞獲得營養和氧氣，從而防止由于?缺乏這些重要材料而導致的死亡。然而，如果細胞在固定相中停留的時間超過特定時間(定義為Cd，在一定范圍內校準，概率為Pd)，細胞就會失去活力。表S1包含了所有芯片參數的值。
統計分析。使用Image J軟件對圖像進行分析。圖表和報告數據中的所有誤差條均表示至少三次重復的±SD?(n≥3)。結果以mean±SD格式報道。共聚焦顯微鏡圖像的統計數據是通過平均每個結構至少?五個不同點的細胞數量獲得的。
數據可用性
支持本研究結果的數據可根據合理要求從通訊作者Dorsa Mohammadrezaei處獲得。
收稿日期:2022年8月13日;錄用日期:2023年1月16日?出版日期:2023年1月21日
